補(bǔ)骨脂和肉豆蔻炮制對(duì)脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠能量代謝的影響

陳志敏， 胡昌江， 潘 新， 趙 玲， 熊 瑞， 耿媛媛， 胡 麟

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137）

補(bǔ)骨脂和肉豆蔻炮制對(duì)脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠能量代謝的影響

陳志敏， 胡昌江*， 潘 新， 趙 玲， 熊 瑞， 耿媛媛， 胡 麟

（成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都611137）

目的從能量代謝角度比較二神丸中補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制前后對(duì)脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠的調(diào)控效應(yīng)。方法采用腺嘌呤灌胃，飲食失節(jié)，服冰番瀉葉水浸劑方法復(fù)制脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠模型，給藥二神丸進(jìn)行治療性實(shí)驗(yàn)，酶標(biāo)儀法檢測(cè)大鼠肝組織中Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase以及乳酸脫氫酶（LDH）活性變化；比色法檢測(cè)肝組織中琥珀酸脫氫酶（SDH）活性變化。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，模型組肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性顯著降低 （P＜0.01）；LDH活性顯著升高 （P＜0.01）。與模型組相比較，二神丸Ⅳ組 （鹽炙補(bǔ)骨脂+麩煨肉豆蔻）Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性明顯升高，LDH活性明顯降低，均具有極顯著性差異（P＜0.01）；與二神丸Ⅰ組（補(bǔ)骨脂生品+肉豆蔻生品）相比較，二神丸Ⅳ組Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性均高于二神丸Ⅰ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）；LDH低于二神丸Ⅰ組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）。結(jié)論經(jīng)鹽炙補(bǔ)骨脂和麩煨肉豆蔻組方的二神丸改善脾腎陽(yáng)虛泄瀉模型大鼠能量代謝效果更加明顯，提示其增效可能與促進(jìn)能量代謝相關(guān)酶活性有關(guān)。

二神丸；補(bǔ)骨脂；肉豆蔻；炮制；能量代謝；ATP；琥珀酸脫氫酶；乳酸脫氫酶

二神丸出自宋·許叔微的《普濟(jì)本事方》，以補(bǔ)骨脂和肉豆蔻組成，具有溫腎暖脾、澀腸止瀉之功效，臨床上常用于脾腎陽(yáng)虛之腎泄證，亦稱“五更泄”、“雞鳴瀉”。方中補(bǔ)骨脂辛苦性溫，補(bǔ)命門之火以溫養(yǎng)脾土，為君藥；以肉豆蔻溫中澀腸為臣藥，與補(bǔ)骨脂相伍，既可增強(qiáng)溫腎暖脾之力，又能澀腸止瀉。在前期研究中已經(jīng)證明二神丸復(fù)方中補(bǔ)骨脂、肉豆蔻分別經(jīng)鹽炙和麩煨后組方入藥能增強(qiáng)固澀止瀉的作用［1-2］，但方中藥物炮制前后對(duì)于 “五更瀉”的作用機(jī)制目前尚無(wú)研究。

現(xiàn)代研究表明，脾腎陽(yáng)虛會(huì)造成機(jī)能減弱或衰退、代謝減緩、產(chǎn)熱不足的病理狀態(tài)，患者常出現(xiàn)畏寒肢冷、精神不振、喜靜萎靡等癥狀，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論中的基礎(chǔ)代謝率及能量代謝水平下降而導(dǎo)致的供能不足所表現(xiàn)的癥狀相似［3-5］。本實(shí)驗(yàn)將補(bǔ)骨脂、肉豆蔻納入二神丸，從能量代謝的角度，以產(chǎn)熱低下、代謝減緩為切入點(diǎn)，借助脾腎陽(yáng)虛泄瀉模型，對(duì)補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制前后組方進(jìn)行探討，為二神丸中藥物炮制增效的機(jī)理以及今后中醫(yī)臨證處方正確選用炮制品提供一定的理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～220 g，由四川達(dá)碩動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（川）2013-24。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 電子天平 （賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限責(zé)任公司）；TGL-16B型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；TU-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；VARIOSKAN FLASH 2.4.3全波長(zhǎng)多功能讀數(shù)儀（美國(guó)Thermo公司）

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 補(bǔ)骨脂和肉豆蔻均購(gòu)于成都市荷花池藥材市場(chǎng)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定分別為豆科植物補(bǔ)骨脂Psoralea corylifolia L.的干燥成熟果實(shí)和肉豆蔻科植物肉豆蔻Myristica fragrans Houtt.的干燥種仁。番瀉葉，購(gòu)于四川千方中藥飲片有限公司，批號(hào)20130101。

腺嘌呤購(gòu)于成都貝斯特試劑有限公司，批號(hào)D110160；Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase、琥珀酸脫氫酶 （SDH）測(cè)試盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào) 20140404；乳酸脫氫酶（LDH）測(cè)試盒、考馬斯亮藍(lán)蛋白定量測(cè)試盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所，批號(hào)20140408。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物炮制及藥液的制備

2.1.1 鹽炙補(bǔ)骨脂 取補(bǔ)骨脂藥材，加入藥材量一半的食鹽水（質(zhì)量濃度為0.02 g/m L），室溫悶潤(rùn)24 h，于150℃炒制10 min后置托盤中于50℃鼓風(fēng)烘箱中烘干。

2.1.2 麩煨肉豆蔻 取肉豆蔻生品與麥麩 （100 g∶40 g）同置鍋內(nèi)，文火加熱，溫度控制在130～150℃，翻炒20 min，至麥麩呈焦黃色，肉豆蔻呈棕褐色。

2.1.3 番瀉葉水浸劑 冷水浸1 h，后加水煮沸約10 min后過(guò)濾，減壓濃縮成1.0 g/mL的藥液。

2.1.4 二神丸藥液 補(bǔ)骨脂和肉豆蔻的量按 《中藥大辭典 （方劑分冊(cè)）》中的2∶1比例配比，即補(bǔ)骨脂生品+肉豆蔻生品 （100 g∶50 g）、補(bǔ)骨脂生品+麩煨肉豆蔻 （100 g∶50 g）、鹽炙補(bǔ)骨脂+肉豆蔻生品 （100 g∶50 g）、鹽炙補(bǔ)骨脂+麩煨肉豆蔻 （100 g∶50 g），粉碎成粗粉，醇水雙提 （先用8倍量的75%的乙醇回流提取1.5 h，過(guò)濾，藥渣用8倍量的75%的乙醇回流提取1 h，過(guò)濾，藥渣用10倍量的水回流提取1 h，過(guò)濾，藥渣用10倍量的水回流提取0.5 h，合并濾液）后濃縮配制成質(zhì)量濃度0.35 g/m L藥液。

2.2 動(dòng)物分組及模型制備 將48只SD雄性大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、二神丸Ⅰ組 （補(bǔ)骨脂生品+肉豆蔻生品）、二神丸Ⅱ組 （鹽炙補(bǔ)骨脂+肉豆蔻生品）、二神丸Ⅲ組 （補(bǔ)骨脂生品+麩煨肉豆蔻）、二神丸Ⅳ組 （鹽炙補(bǔ)骨脂+麩煨肉豆蔻）共6組。除正常對(duì)照組之外，其余各組均按以下方法進(jìn)行復(fù)合造模：腺嘌呤200 mg/kg劑量，用前配制成懸濁液 （2 g/100 mL生理鹽水），灌胃4周致腎陽(yáng)虛；單日、雙日交替喂飼甘藍(lán) （10g/只）和精煉豬油（2 mL/只）致飲食失節(jié)，附以每日下午游泳致勞倦過(guò)度以傷脾氣，從第3周起在之前造模基礎(chǔ)上再通過(guò)給予灌服冰番瀉葉水浸劑，以1 mL/100 g體質(zhì)量劑量灌胃2周達(dá)以傷脾陽(yáng)［6-9］。同時(shí)第3周起 “二神丸”各組均按3.5 g/kg劑量，連續(xù)灌胃給藥2周。

經(jīng)過(guò)上述方法造模后大鼠出現(xiàn)飲水?dāng)z食量減退，活動(dòng)減少，體質(zhì)量減輕，體毛枯疏、失去光澤，大便溏泄、尿量增多，倦怠嗜臥，體溫下降、畏寒蜷縮喜扎堆，個(gè)別動(dòng)物出現(xiàn)脫肛，甚至死亡等一系列與類似中醫(yī) “脾腎陽(yáng)虛”狀態(tài)［10］，并且在造模第2周起出現(xiàn)稀便，第3周出現(xiàn)溏泄；此外，該復(fù)合造模方法實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果顯示造模后大鼠血清cAMP下降，cGMP上升，cAMP/cGMP比值明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），表明脾腎陽(yáng)虛泄瀉大鼠模型造模成功。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行4周，結(jié)束次日處死并取樣 （取樣前禁食不禁水12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉，頸部脫臼處死，迅速剖開(kāi)腹腔取出肝組織。）。

2.3 肝組織勻漿的制備及蛋白定量 參照南京建成組織勻漿上清液制備實(shí)驗(yàn)方法學(xué)。實(shí)驗(yàn)之前將生理鹽水預(yù)冷，用生理鹽水快速洗盡組織上血液后，用濾紙將其拭干。準(zhǔn)確取肝組織稱定質(zhì)量，按質(zhì)量（g）∶體積 （mL）=1∶9的比例，冰袋上快速地剪碎組織塊后倒入玻璃勻漿器中，冰水浴條件下勻漿，2 500 r/min離心10 min。取上清液（即10%的勻漿上清液），再用生理鹽水10倍稀釋成1%。肝組織勻漿按照考馬斯亮藍(lán)蛋白定量測(cè)試盒說(shuō)明書進(jìn)行蛋白定量，蛋白質(zhì)量濃度=（測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）×對(duì)照品質(zhì)量濃度 （0.563 g/L）。

2.4 肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性變化 按ATPase試劑盒說(shuō)明書要求進(jìn)行規(guī)范化操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。再根據(jù)公式計(jì)算，ATPase活力=（測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（0.02μmol/mL）×反應(yīng)體系中樣本稀釋倍數(shù)× 6÷勻漿蛋白濃度。

2.5 肝組織SDH、LDH活性變化 按照SDH測(cè)試盒說(shuō)明書要求進(jìn)行規(guī)范化操作，用分光光度計(jì)在600 nm處比色，分別讀取反應(yīng)5 s、65 s時(shí)的吸光光度值（OD5 s、OD65 s），再根據(jù)公式計(jì)算，組織中SDH活性=［OD5s-OD65s）/0.01］/［反應(yīng)時(shí)間min×（取樣量mL×勻漿蛋白濃度）］；

按照LDH測(cè)試盒說(shuō)明書要求進(jìn)行規(guī)范化操作，用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。再根據(jù)公式計(jì)算，組織中LDH活性=（測(cè)定管OD值-對(duì)照管OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)管OD值-空白管OD值）×標(biāo)準(zhǔn)管濃度（0.2μmol/mL）÷勻漿蛋白濃度。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法 采用Spss 19.0統(tǒng)計(jì)軟件做數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以 （x±s）表示。采用單因素方差分析，以P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性變化 與正常對(duì)照組相比較，模型組大鼠Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase活性顯著降低（P＜0.01），表明機(jī)體處于供能不足、能量代謝低下、代謝紊亂，這與模型大鼠的狀態(tài)相符，給藥二神丸能提高Na+-K+-ATPase與Ca2+-Mg2+-ATPase活性，從而促進(jìn)ATP的分解，保持細(xì)胞內(nèi)外正常的離子濃度和膜電位，調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝。在二神丸四個(gè)組合中，以二神丸Ⅳ組相對(duì)于其他組效果最佳 （具體結(jié)果見(jiàn)表1）。

表1 各組大鼠肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-M g2+-ATPase活性的比較（U/mgprot）（x±s）Tab.1 Comparison of the Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase activity in rats liver among different groups（U/mgprot）（x±s）

3.2 肝組織SDH、LDH活性變化 與正常對(duì)照組相比較，模型組大鼠SDH活性降低，LDH活性明顯升高，二者均有極顯著性差異 （P＜0.01），說(shuō)明機(jī)體有氧氧化供能不足，能量代謝低下。給藥二神丸后，大鼠SDH活性升高，LDH水平下調(diào)，從而改善機(jī)體細(xì)胞的能量代謝，使肝臟維持正常的代謝功能，機(jī)體處于代謝旺盛狀態(tài)，且在四種組方中二神丸Ⅳ組效果更好 （具體結(jié)果見(jiàn)表2）。

4 討論

二神丸是臨床治療五更泄瀉的基礎(chǔ)方，其病機(jī)在于脾腎陽(yáng)虛。補(bǔ)骨脂鹽炙后可引藥入腎，增強(qiáng)溫腎助陽(yáng)、納氣止瀉的作用，現(xiàn)代研究表明，補(bǔ)骨脂炮制后，補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素含有量降低，但其吸收明顯增加［11］，與 “腎”關(guān)系密切的微量元素Mn、Ca、Mg、Fe、Zn含有量增加［12］；肉豆蔻煨制可增強(qiáng)固腸止瀉的作用，研究表明煨制后肉豆蔻中甲基丁香酚、甲基異丁香酚等是其揮發(fā)油止瀉的主要有效成分，經(jīng)過(guò)炮制后這兩種成分明顯增加［13］。Ca、Mg、Zn等微量元素在免疫調(diào)節(jié)和能量代謝方面起著重要作用，并且炮制后有效成分及吸收速率的增加也能增強(qiáng)療效，但這些研究多局限于單味藥，鮮有基于復(fù)方的研究。因此本實(shí)驗(yàn)將補(bǔ)骨脂和肉豆蔻的生品和其炮制品組合配方，得到4個(gè)組，以 “脾腎陽(yáng)虛泄瀉”大鼠模型為研究對(duì)象進(jìn)行考察。

表2 各組大鼠肝組織SDH、LDH活性的比較（U/mgprot）（x±s）Tab.2 Com parison of the SDH and LDH activity in rats liver am ong different groups（U/mgp rot）（x±s）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)復(fù)合因素造模后模型大鼠肝組織Na+-K+-ATPase、Ca2+-Mg2+-ATPase及SDH活性顯著降低，LDH水平升高，表明模型大鼠發(fā)生能量代謝的紊亂，給藥二神丸后，上述指標(biāo)均較模型組有所改善，使機(jī)體能量代謝處于活躍狀態(tài)，且二神丸Ⅳ組的作用優(yōu)于其他3組，說(shuō)明 “二神丸”中補(bǔ)骨脂和肉豆蔻分別經(jīng)過(guò)鹽炙和煨炙后對(duì)脾腎陽(yáng)虛的治療效果最好。

本實(shí)驗(yàn)從能量代謝角度，闡明了二神丸中補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制前后組方入藥對(duì) “五更瀉”本質(zhì)脾腎陽(yáng)虛的影響。提示二神丸能提高脾腎陽(yáng)虛大鼠低下的能量代謝水平，尤以補(bǔ)骨脂、肉豆蔻均炮制后組方入藥效果更佳，因此臨床上在治療脾腎陽(yáng)虛之腎泄證時(shí)，應(yīng)以鹽炙補(bǔ)骨脂和煨制肉豆蔻入藥更好。

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［2］潘 新，胡昌江，耿媛媛，等.補(bǔ)骨脂、肉豆蔻炮制前后在“二神丸”中對(duì)脾腎陽(yáng)虛泄瀉小鼠的止瀉研究［J］.中成藥，2014，36（5）：1059-1062.

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Effect of processed Buguzhi and Roudoukou on energy metabolism in rats with spleen-kidney yang deficiency diarrhea

CHEN Zhi-min， HU Chang-jiang*， PAN Xin， ZHAO Ling， XIONG Rui， GENG Yuan-yuan，HU Lin
（College of Pharmacy，Chengdu University of TCM，Chengdu 611137，China）

AIMTo compare the effects of after and before processing of Buguzhi（Psoraleae Fructus）and Roudoukou（Myristicae Semen）which comprised Ershen Pills on rats with spleen-kidney yang deficiency diarrhea from the viewpoint of energeticmetabolism.METHODSThe ratsmodels for the spleen-kidney yang deficiency diarrheaweremade through the perfusion of adenine，irregular diet，and reception of ice senna extract.Themodels were treated with Ershen Pills.The activity of Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase and lactate dehydrogenase（LDH）in the liver tissue weremeasured by enzyme-linked immunosorbantassay.And the activity of succinate dehydrogenase（SDH）was observed by the colorimetric method.RESULTSIn comparison to the normal control group，processed Buguzhi and Roudoukou expressed a lower level of Na+-K+-ATPase（P＜0.01），Ca2+-Mg2+-ATPase（P＜0.01）and SDH（P＜0.01），and a higher level of LDH（P＜0.01）in model group.Compared with themodel group，the Ershen PillsⅣgroup could enhance the level of Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase and SDH activity，decrease the level of LDH activity.There were extremely significant differences（P＜0.01）. The Na+-K+-ATPase，Ca2+-Mg2+-ATPase and SDH activity in Ershen PillsⅣgroup were higher than those in Ershen PillsⅠgroup，the difference was statistically significant（P＜0.05）.The LDH activity in Ershen PillsⅣgroup was lower than that in Ershen PillsⅠgroup，the difference was also statistically significant（P＜0.05）.CONCLUSIONErshen Pills，consisting of salt-frying Buguzhiand bran-roasting Roudoukou，has the function of improving the energetic metabolism of rats with spleen-kidney yang deficiency diarrhea，which may be related to relevant enzymes.

Ershen Pills；Buguzhi（Psoraleae Fructus）；Roudoukou（Myristicae Semen）；processing；energetic metabolism；ATP；SDH；LDH

R283.1

：A

：1001-1528（2015）06-1298-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.030

2014-07-10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目 （81274085）

陳志敏 （1990—），碩士生，主要從事中藥炮制與制劑研究。Tel：15281087650，E-mail：346578767@qq.com。

*通信作者：胡昌江 （1952—），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制學(xué)的教學(xué)和科研。Tel：13980980796，E-mail：hhccjj@hotmail.com