HPLC-ELSD法分析破壁靈芝孢子粉的多糖組成

尚 姝， 于 青

（1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，江蘇南京210008；2.中國藥科大學(xué)，江蘇南京210009）

HPLC-ELSD法分析破壁靈芝孢子粉的多糖組成

尚 姝1， 于 青2

（1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院，江蘇南京210008；2.中國藥科大學(xué)，江蘇南京210009）

目的建立HPLC-ELSD法對破壁靈芝孢子粉中多糖的單糖組成進行分析。方法采用Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈-水 （83∶17）；體積流量1.0 m L/m in；進樣量10μL；柱溫30℃；ELSD檢測條件為漂移管溫度85℃，載氣體積流量2.0 mL/min。結(jié)果巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的進樣量對數(shù)與峰面積對數(shù)在一定范圍內(nèi)均呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系，回收率均在87.5%～97.4%之間，而且RSD（n=6）均小于2%。結(jié)論該方法準(zhǔn)確可靠，分離效果好，可用于破壁靈芝孢子粉多糖的單糖組成分析。

破壁靈芝孢子粉；高效液相蒸發(fā)光散射；多糖；單糖

靈芝為多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum（Leyss.ex Fr.）Karst.或紫芝G.sinense Zhao，Xu et Zhang的干燥子實體［1］，而靈芝孢子則是靈芝進入生長成熟期后，從其菌褶中彈射出來的靈芝種子［2］。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，靈芝孢子粉具有比子實體更突出的功效［3］，其有效成分的種類和含有量均高于子實體［4］。對靈芝孢子進行破壁處理后發(fā)現(xiàn)，其提取液中有效成分含有量明顯高于未破壁孢子［5］。靈芝多糖作為靈芝孢子中的有效成分，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗氧化、抗衰老等藥理活性［6-7］，含有量達(dá)到 0.32% ～1.61%不等［8-9］。

目前靈芝多糖的定量測定方法有紫外分光光度法、薄層色譜法［10-11］、高效液相色譜-UV檢測法［12-13］、 離子色譜法［14］和高效毛細(xì)管電泳法［15］等。本實驗采用HPLC結(jié)合通用型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）對靈芝孢子粉多糖的單糖組成進行分析，其主要優(yōu)點是樣品無需衍生化即可測定，并能夠排除其他成分及輔料的干擾。實驗中使用相對于糖柱成本較低的氨基柱，能快速有效地對多糖中的單糖組成進行定性、定量分析，且該方法通用性強，重復(fù)性好，易于推廣應(yīng)用，為破壁靈芝孢子粉中多糖的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-30AD型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），包括Alltech ELSD 2000ES檢測器；GA-10B低噪音空氣泵（北京中興匯利科技發(fā)展有限公司）；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）；MX5電子天平（瑞士Mettler公司）；純水儀（美國Millipore公司）；CPA224S電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試劑 三氟乙酸 （分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；乙腈 （色譜純，美國Fisher公司）；乙醇 （分析純，南京化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水 （自制）。

1.3 對照品 甘露糖、葡萄糖、木糖、果糖、核糖、阿拉伯糖 （國藥集團化學(xué)試劑有限公司，純度均大于 98%，批號分別為 20121224、20130325、20130225、20121017、20121127、20121227）；半乳糖 （惠興生化試劑有限公司，純度100%，批號為20120916）；巖藻糖 （阿拉丁化學(xué)試劑公司，純度100%，批號為D1303057）；氨基半乳糖 （美國Sigma-aldrich公司，純度100%，批號為1001486728）。1.4 樣品 來源于3個廠家的市售破壁靈芝孢子粉3批，批號分別為A、B、C。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Shodex Asahipak NH2P-50 4E色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相為乙腈-水（83∶17）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫30℃；對照品進樣量為10μL，樣品為100μL。蒸發(fā)光散射檢測器的檢測條件為漂移管溫度85℃，載氣體積流量2.0 L/min，增益1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取葡萄糖50.34 mg、巖藻糖50.87 mg、氨基葡萄糖40.80 mg、果糖25.28 mg、氨基半乳糖80.19 mg、木糖201.39 mg、甘露糖403.98 mg、半乳糖805.24 mg、阿拉伯糖1 008.35 mg，置同一50 m L量瓶中，加水溶解并定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取研細(xì)混勻的樣品內(nèi)容物3 g，精密稱定，置250 mL碘量瓶中，加水150 mL，水浴提取2 h，取出放冷，離心后取上清液。殘渣再加水提取2次，提取液合并，減壓濃縮，加入無水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，4℃下放置12 h后取出，離心，棄去上清液。沉淀加水溶解，加入Sevage試劑混勻，振蕩后離心，取上清液。重復(fù)上述操作，直至無渾濁產(chǎn)生，減壓濃縮，加無水乙醇使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)80%，沉淀完全，減壓干燥后備用。將所得多糖干燥品轉(zhuǎn)移到水解罐中，加入TFA，于110℃烘箱中水解，冷卻后轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加水洗滌，蒸干，用水重復(fù)洗滌3次，至TFA蒸發(fā)完全，加60%乙腈轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中定容，搖勻后經(jīng)微孔濾膜濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性實驗 在 “2.1”項色譜條件下，巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖9種單糖分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以9種糖計均不低于4 000，如圖1所示。

圖1 溶劑空白 （A）、對照品溶液 （B）、樣品溶液 （C）、稀釋后的樣品溶液（D）的HPLC-ELSD色譜圖Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of blank（A）、m ixed reference substances（B），sam p le（C）and diluted sam p le（D）

2.4 線性關(guān)系 精密量取對照品溶液適量，用60%乙腈稀釋成對照品系列溶液。按 “2.1”項下的色譜條件測定。以單糖峰面積的對數(shù)為縱坐標(biāo)y，對照品進樣量的對數(shù)為橫坐標(biāo)x，進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 9種單糖的線性方程和線性范圍Tab.1 Regressive equation and linear range of 9 monosaccharides

2.5 檢測限與定量限 將對照品溶液的色譜信號峰與基線信號進行比較，以信噪比約為3∶1時注入儀器的量確定為檢測限，約為10∶1時注入儀器的量確定為定量限，得到9種單糖檢出限和定量限。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖的檢測限分別為0.1、2.0、0.4、0.05、0.16、0.08、0.8、1.6、0.1μg；定量限分別為 0.3、6.0、1.5、0.2、0.5、0.3、3.2、5.0、0.4μg。

2.6 儀器精密度 取對照品貯備液稀釋到一定濃度，在 “2.1”項色譜條件下，測得9種單糖的峰面積值，得到巖藻糖、阿拉伯糖、木糖、果糖、氨基半乳糖、氨基葡萄糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖峰面積的RSD分別為1.8%、3.1%、1.2%、2.2%、2.5%、3.6%、2.6%、1.7%、1.5% （n =6），表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性 取廠家A靈芝孢子粉，按 “2.2.2”項下方法，平行制備6份供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下，檢出5種單糖，并測定其峰面積。結(jié)果表明，巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖的RSD分別為2.4%、3.3%、5.2%、1.9%、1.7%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性 取同一份供試品溶液，在 “2.1”項色譜條件下，于0、2、4、8、12、24 h測定，結(jié)果檢出5種單糖，并測得其峰面積。結(jié)果表明，巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖重復(fù)性的RSD分別為 2.1%、1.9%、1.8%、3.6%、2.3%，表明供試品在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 準(zhǔn)確度 取廠家A靈芝孢子粉樣品6份，每份稱取 1.5 g，加入一定量的對照品溶液，按“2.2.2”項方法操作，制備回收率用供試品溶液。在 “2.1”項色譜條件下，測定9種單糖峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2，表明方法準(zhǔn)確度良好。

表2 9種單糖的水解回收率試驗考察 （n=6）Tab.2 Results of recovery tests for 9 m onosaccharides（n=6）

2.10 樣品的測定 取3個品牌的破壁靈芝孢子粉，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按 “2.1”項下的色譜條件進行實驗。由于葡萄糖量太高，超出線性范圍，故將上述供試品溶液稀釋10倍后進樣10μL，測定葡萄糖的量，樣品的水解產(chǎn)物如圖1所示。結(jié)果表明，破壁靈芝孢子粉中靈芝多糖的水解產(chǎn)物主要為葡萄糖，另外還含有少量的木糖、甘露糖、半乳糖和巖藻糖等，見表3。

表3 破壁靈芝孢子粉樣品中多糖的水解液中單糖的測定結(jié)果Tab.3 Results of monosaccharide contents in hydrolysate of polysaccharide in broken spore powder from Ganoderma lucidum sam p le

3 討論

3.1 色譜柱的選擇 測定單糖的色譜柱一般有糖柱和氨基柱，但糖柱價格昂貴，故選擇常規(guī)的氨基柱進行破壁靈芝孢子粉中的單糖分析。本實驗比較了Agilent ZORBAX NH2柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Sepax HP-Amino氨基柱（4.6 mm×300 mm，5μm）以及Shodex Asahipak NH2P-50 4E柱（4.6 mm×250 mm，5μm）分離9種單糖的效果。結(jié)果表明，Agilent氨基柱及Sepax氨基柱可能因氨基易流失，從而基線易上移，而Shodex氨基柱是以聚合物為基材的氨基柱，化學(xué)穩(wěn)定性良好，對流動相的耐受性更好，分離度理想，柱效高，故選擇此柱作為本實驗的分析柱。

3.2 流動相系統(tǒng)的優(yōu)化 高效液相色譜法分析糖類化合物所用流動相一般為水和乙腈的混合溶液。氨基柱在分離單糖時表現(xiàn)為正相的保留機理，隨著乙腈比例增加，單糖保留增強，分離度上升。調(diào)整乙腈的比例分別為80%、85%、83%，綜合單糖之間的分離度和分析時間，選擇83%的乙腈作為流動相。

3.3 ELSD條件的選擇 影響ELSD的兩個重要參數(shù)是漂移管溫度和載氣體積流量，兩者對組分的保留時間影響較小，但對信噪比的影響較大，因此建立適當(dāng)?shù)腍PLC-ELSD分析方法時，需對這兩個參數(shù)進行優(yōu)化。經(jīng)過實驗考察，綜合響應(yīng)和噪音大小，選擇漂移管溫度為85℃，載氣體積流量為2.0 mL/min。

3.4 水解條件的優(yōu)化 水解是單糖組成分析和含量測定的關(guān)鍵步驟，對其條件進行優(yōu)化十分必要。本實驗使用蒸發(fā)光散射檢測器，故選用易揮發(fā)的TFA作為水解用酸，考察了TFA濃度、水解時間及水解溫度。最終確定實驗條件為TFA濃度2 mol/L，水解溫度為110℃，水解時間2 h，密封。

3.5 樣品比較分析 三個廠家產(chǎn)品的單糖含有量差異較大，最高與最低差異約有7倍，這說明不同廠家之間的產(chǎn)品質(zhì)量有明顯區(qū)別。

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Analysis of m onosaccharides of polysaccharides in broken spore powder from Ganoderma lucidum by HPLC-ELSD

SHANG Shu1， YU Qing2
（1.Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing 210008，China；2.China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，China）

AIMTo develop an HPLC-ELSD method for analyzingmonosaccharide composition of polysaccharides in broken spore powder isolated from Ganoderma lucidum.METHODSThe separation was performed on Shodex Asahipak NH2P-50 4E（4.6 mm×250mm，5μm）.Themobile phase was composed of acetonitrile-water（83∶17）ata flow rate of1.0mL/min，the column temperaturewasmaintained at30℃.The drift tube temperature of ELSD was set at85℃and gas flow was 2.0 mL/min.RESULTSFucose，arabinose，xylose，fructose，galactosamine，glucosamine，mannose，galactose and glucose all had good linearity.Their recoveries ranged from 87.5%-97.4%with RSDs less than 2%（n=6），respectively.CONCLUSIONThe proposedmethod isaccurate and has good separation，which can be used for the analysis ofmonosaccharide composition of polysaccharides in broken spore powder G.lucidum.

broken spore powder from Ganoderma lucidum；HPLC-ELSD；polysaccharides；monosaccharide

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1272-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.024

2014-09-24

尚 姝（1981—），女，碩士，主管藥師，從事藥物分析研究。Tel：（025）86630712，E-mail：copymee@126.com