中藥三萜皂苷合成通路的生物信息學分析

張召寶， 侯 林， 崔清華， 潘 晴， 馬魯豫

（1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東濟南250300；2.山東省醫(yī)學科學院，山東濟南250062）

中藥三萜皂苷合成通路的生物信息學分析

張召寶1， 侯 林1， 崔清華1， 潘 晴1， 馬魯豫2*

（1.山東中醫(yī)藥大學藥學院，山東濟南250300；2.山東省醫(yī)學科學院，山東濟南250062）

目的從系統(tǒng)進化學角度對中藥三萜皂苷合成通路中關鍵酶進行生物信息學分析。方法從NCBI數(shù)據(jù)庫下載已有17種中藥中的鯊烯合成酶、鯊烯環(huán)氧酶、2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶的蛋白質(zhì)全長序列，通過生物信息學軟件對其進行理化性質(zhì)分析、保守域分析、蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預測和系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建。結(jié)果序列分析表明，鯊烯合成酶、鯊烯環(huán)氧酶、2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶的蛋白質(zhì)序列保守性均較高。其中鯊烯合成酶具有兩個高度保守的區(qū)域——富含天冬氨酸的鎂離子結(jié)合位點1和2——可作為認定鯊烯合成酶的依據(jù)；鯊烯環(huán)氧酶和2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶的蛋白三維結(jié)構(gòu)保守，無規(guī)則卷曲部分為高變區(qū)。結(jié)論上游合成在進化中趨于保守和穩(wěn)定；三萜皂苷眾多類型的形成可能與下游細胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶、β-糖苷酶等的修飾有關。

三萜皂苷；鯊烯合成酶；鯊烯環(huán)氧酶；2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶

三萜皂苷（triterpenoid saponins）是一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛分布于人參［1］、靈芝［2］、三七［3］、墨旱蓮［4］等中藥中，并作為其主要的活性成分，具有抗癌、抗氧化、消炎解毒等功效。

目前，人們對三萜皂苷的合成通路已有較為明確的認識［5］。首先通過甲羥戊酸等途徑合成異戊二烯焦磷酸，然后經(jīng)過香葉基二磷酸合酶、法尼基焦磷酸合酶、鯊烯合成酶和鯊烯環(huán)氧酶的催化，形成2，3-氧化鯊烯，再通過2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶環(huán)化形成三萜類骨架，最后通過細胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶、β-糖苷酶的修飾作用，形成復雜的糖苷化合物——三萜皂苷。

三萜皂苷主要從栽培藥材中提取，但存在種類少、產(chǎn)量低、受環(huán)境影響大、收獲周期長等問題，難以滿足市場需求［6］。本研究系統(tǒng)分析了三萜皂苷合成通路中的關鍵酶，可增加對其進化規(guī)律的認識，發(fā)掘更多的相關藥用資源，為今后利用基因工程技術實現(xiàn)其大規(guī)模人工合成打下堅實基礎。

1 資料來源

截止到2014年3月27日，從NCBI數(shù)據(jù)庫下載鯊烯合成酶蛋白質(zhì)全長序列，共31條，包括人參Panax ginseng C.A.Mey.、三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen等17種中藥的24條序列；下載鯊烯環(huán)氧酶蛋白質(zhì)全長序列，共19條，包含人參、蛇足石杉Huperzia serrata（Thunb.ex Murray）Trev.等5種中藥材的7條序列；下載2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶蛋白質(zhì)全長序列，共8條，包括人參、蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、總狀升麻Cimicifuga racemosa（Turcz.）Maxim.和百脈根Lotus corniculatus這4種中藥材的4條序列。相關序列的NCBI號在系統(tǒng)進化樹中列出。

2 方法

2.1 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 蛋白質(zhì)全長序列的理化性質(zhì)應用在線軟件ExPASy（http：//www.expasy.org/）分析。其中，利用ProtParam模塊根據(jù)具體的氨基酸序列，進行氨基酸數(shù)目、相對分子質(zhì)量、理論等電點和不穩(wěn)定指數(shù)的測算，然后利用ProtScale模塊進行親水性/疏水性分析。

2.2 結(jié)構(gòu)域分析 在NCBI的Conserved Domain Database［7］和SMART［8］（http：//smart.embl-heidelberg.de/）數(shù)據(jù)庫中進行蛋白質(zhì)的保守域和功能域預測，并通過WebLogo［9］對其做進一步分析。利用基于同源建模的分析工具SWISS-MODEL［10］（http：//swissmodel.expasy.org/）預測蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。

2.3 構(gòu)建系統(tǒng)進化樹 利用MEGA 5.0軟件［11］中的ClustalW進行序列比對，然后利用Neighbor-Joining（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（bootstrap= 1000）。

3 結(jié)果與分析

3.1 鯊烯合成酶 鯊烯合成酶（squalene synthase，EC 2.5.1.21）是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的膜結(jié)合蛋白［12］。在類異戊二烯代謝途徑中，它以法尼二磷酸為底物，催化合成30C產(chǎn)物角鯊烯。由于處于甾醇與三萜合成通路的分支點，決定著法尼基焦磷酸的流向，因此鯊烯合成酶發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

已有研究表明，鯊烯合成酶的結(jié)構(gòu)和反應機制在動植物中相當保守。見表1。

表1 藥用植物鯊烯合成酶蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chem ical properties of medicinal plants squalene synthase protein sequences

在哺乳動物中，該成分大約包含416 aa，相對分子質(zhì)量約為47 kDa；在模式植物擬南芥中，該成分有2個 （NP_195190.1和NP_195191.2），其外顯子具有高度同源性［13］。本研究從NCBI數(shù)據(jù)庫中共下載得到17種中藥的24條蛋白質(zhì)全長序列，長度在405～418 aa之間，相對分子質(zhì)量在45.89～47.89 kDa之間，理論等電點在6.07～8.53之間，多數(shù)為不穩(wěn)定蛋白質(zhì) （不穩(wěn)定指數(shù)＞40）。以人參中的三條鯊烯合成酶序列（BAD08242.1，ACV88718.1和ACZ71037.1）為例，利用ProtScale模塊進行疏水性/親水性分析，由于其序列高度保守，所展現(xiàn)出的親水性/疏水性規(guī)律較為一致，見圖1。另外由圖可知，鯊烯合成酶的N端分布有親水域 （分值＜-0.5），而C端則分布有一段較短的強疏水域 （分值＞0.5），這與之前有關鯊烯合成酶細胞定位的報道相一致。鯊烯合成酶通過短的C端跨膜區(qū)錨定于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，而N端的催化域則伸向胞質(zhì)溶膠中［14］。

圖1 鯊烯合成酶疏水性/親水性分析Fig.1 Hydroponic/hydrophilic analysis of squalene synthases in P.ginseng

在對其序列進行理化性質(zhì)分析的基礎上，進一步研究其保守域。首先采用WebLogo對Lee［15］等報道的6個保守域進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在17種中藥中，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ三個保守域高度保守，而Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ三個保守域保守性較差，見圖2 A。由此可見，之前對這6個保守域的報道具有一定局限性。根據(jù)NCBI的Conserved Domain Database的預測結(jié)果比對發(fā)現(xiàn)，這17種中藥中的鯊烯合成酶具有兩個高度保守 （100%）的區(qū)域——富含天冬氨酸的鎂離子結(jié)合位點1和2，見圖2 B（結(jié)合位點1位于77～81 aa，結(jié)合位點2位于213～217 aa），該區(qū)域與15C法尼基和20C香葉基異戊二烯基二磷酸的1＇-1＇位縮合反應相關，其保守性保證了鯊烯合成酶與底物特異性結(jié)合，并可作為今后鑒定中藥中該成分的重要依據(jù)。以人參中的三條鯊烯合成酶序列（BAD08242.1，ACV88718.1和ACZ71037.1）為例，SWISS-MODEL建模的結(jié)果顯示，人參中鯊烯合成酶的三維結(jié)構(gòu)相對保守，以α螺旋為主，而β折疊片較少，無規(guī)則卷曲等結(jié)構(gòu)均很保守（圖2 C）。

圖2 鯊烯合成酶保守域分析Fig.2 Conserved domain analysis of squalene synthases

以模式物種擬南芥等植物中的鯊烯合成酶蛋白質(zhì)全長構(gòu)建進化樹，見圖3。由圖可知，進化樹首先分為兩大支，其中上面一支主要包含較高等的植物類群，主要為雙子葉植物；下面一支以紫杉Taxus chinensis（Pilger）Rehd.、馬尾松Pinusmassoniana為代表，多為較低等的植物類群。整體而言，鯊烯合成酶具有較高的保守性和較為普遍的基因倍增現(xiàn)象，例如人參、丹參、北柴胡等6種中藥具有兩個及兩個以上鯊烯合成酶。由于其具有較為重要的生理生化功能，故認為適應性進化可能導致了普遍的基因倍增，從而產(chǎn)生了不同的亞型，之間可能存在的功能上的互補和增強，又是酶功能進化的一種體現(xiàn)。

圖3 鯊烯合成酶系統(tǒng)進化樹 （NJ法）Fig.3 Phylogenetic tree of squalene synthases

3.2 鯊烯環(huán)氧酶 鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，EC 1.14.13.132）是一種細胞膜結(jié)合蛋白，催化三萜合成的第一步氧化反應，是該合成通路的限速酶之一［16］。

從NCBI中共下載得到7條中藥鯊烯環(huán)氧酶的蛋白質(zhì)全長序列，其長度在537～561 aa之間，相對分子質(zhì)量在59.13～62.79 kDa之間，理論等電點在8.63～9.19之間，全部為不穩(wěn)定蛋白質(zhì) （不穩(wěn)定指數(shù)＞40）（見表2）。

表2 藥用植物鯊烯環(huán)氧酶蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)Tab.2 Physical and chem ical properties of medicinal p lants squalene epoxidase protein sequences

以三七和人參中的鯊烯環(huán)氧酶序列為例，利用ProtScale模塊進行疏水性/親水性分析，可以看出，三七和人參中的兩條鯊烯環(huán)氧酶蛋白質(zhì)全長序列出現(xiàn)了較為明顯的分化；三七中的ABE73759.1與人參的BAA24448.1具有較為一致的親水性/疏水性規(guī)律；三七中的 AFV92748.1與人參的ACJ24907.2具有較為一致的親水性/疏水性規(guī)律；這說明這兩種亞型之間的分化早于三七和人參之間的分化，并在隨后的進化中形成了自己獨特的親水性/疏水性規(guī)律 （圖4）。

圖4 鯊烯環(huán)氧酶疏水性/親水性分析Fig.4 Hydroponic/hydrophilic analysis of squalene epoxidases in P.notoginseng and P.ginseng

對其進行功能域分析，見圖5 A。由圖可知，鯊烯環(huán)氧酶的C端含有一個高度保守的跨膜結(jié)構(gòu)域（5～27 aa），然后是1個重疊的FAD結(jié)合域（NADPH結(jié)合域，60～408 aa）和鯊烯環(huán)氧酶結(jié)構(gòu)域 （pfam08491，211～484 aa）。藥用植物中的鯊烯環(huán)氧酶蛋白質(zhì)序列呈現(xiàn)出較高的同源性，以模式植物擬南芥和中藥代表物種人參為例，通過SWISS-MODEL進行三維結(jié)構(gòu)的預測，見圖5 B。由圖可知，鯊烯環(huán)氧酶的α螺旋和β折疊片等結(jié)構(gòu)保守，無規(guī)則卷曲部分為可變區(qū)，其中連接β折疊片者較為高變。

以模式物種擬南芥等植物中的鯊烯環(huán)氧酶蛋白質(zhì)全長構(gòu)建進化樹，見圖6。由圖可知，進化地位較為低等的蕨類植物——蛇足石杉作為外群，位于進化樹的底部；五加科的人參、三七、刺五加等植物聚為一支，顯示出較近的親緣關系。該進化樹較好地符合物種之間的進化規(guī)律，說明鯊烯環(huán)氧酶伴隨物種的進化進程趨于保守，只在特定類群中出現(xiàn)了基因倍增的現(xiàn)象，如五加科，這可能與該科物種特定的生境與生理習性相關，例如，某種環(huán)境壓力迫使其特定通路的完善或者特定代謝產(chǎn)物的富集。

圖5 鯊烯環(huán)氧酶保守域及三維結(jié)構(gòu)分析Fig.5 Conserved domains and 3D structure analysis of squalene epoxidases

圖6 鯊烯環(huán)氧酶系統(tǒng)進化樹 （NJ法）Fig.6 Phylogenetic tree of squalene epoxidases

3.3 2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶 氧化鯊烯環(huán)化酶（oxidosqualene cyclases，EC 5.4.99.7）是一大類氧化鯊烯環(huán)化酶的統(tǒng)稱，能催化一系列復雜的環(huán)化和重排反應。在植物中，由于它可催化三萜皂苷合成中的第一步環(huán)化反應，因而被認為是合成通路中的關鍵酶。

表3 藥用植物氧化鯊烯環(huán)化酶蛋白質(zhì)序列的理化性質(zhì)Tab.3 Physical and chem ical properties of medicinal p lants oxidosqualene cyclase p rotein sequences

本研究對其中的2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶進行深入的分析，發(fā)現(xiàn)它在真菌、動物和植物中均較為保守。從NCBI中共下載得到4條中藥的2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶全長蛋白序列，包括人參、百脈根、蒲公英、總狀升麻，長度在757～780 aa之間，相對分子質(zhì)量在86.18～88.83 kDa之間，理論等電點在5.89～8.07之間，全部為不穩(wěn)定蛋白質(zhì) （不穩(wěn)定指數(shù)＞40），見表3。利用ProtScale模塊對其進行疏水性/親水性分析，可見4條中藥的2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶序列具有較為一致的親水性/疏水性整體規(guī)律，但親水區(qū)域和疏水區(qū)域的強弱程度略有不同，見圖7。

圖7 2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶疏水性/親水性分析Fig.7 Hydroponic/hydrophilic analysis of 2，3-oxidosqualene cyclases

通過SWISS-MODEL進行三維結(jié)構(gòu)的預測，見圖8。由圖可知，2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，與模式植物擬南芥相比，無規(guī)則卷曲部分存在一定程度變化，而且其多分布于蛋白質(zhì)表層。但由于序列有限，構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹并不能很好地反應該酶的系統(tǒng)進化規(guī)律，見圖9。

圖8 2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶三維結(jié)構(gòu)分析Fig.8 3D structure analysis of 2，3-oxidosqualene cyclases

圖9 2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶系統(tǒng)進化樹 （NJ法）Fig.9 Phylogenetic tree of 2，3-oxidosqualene cyclases

4 討論

中藥中所含的三萜皂苷成分類型眾多，而且結(jié)構(gòu)復雜。通過對其合成通路中關鍵酶的系統(tǒng)分析發(fā)現(xiàn)，鯊烯合成酶、鯊烯環(huán)氧酶、2，3-氧化鯊烯環(huán)化酶均較為保守，說明雖然三萜皂苷的合成是一個高度復雜的動態(tài)過程，但其苷元碳環(huán)骨架構(gòu)成等上游步驟在進化中趨于保守和穩(wěn)定，而且該成分眾多類型的形成可能與下游細胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶、β-糖苷酶等的修飾有關。另外，不同類型細胞色素P450催化的羥化反應和糖基轉(zhuǎn)移酶催化的糖基反應可能是物種特異性三萜皂苷形成的原因。但由于細胞色素P450和糖基轉(zhuǎn)移酶均為超家族［17-19］，序列的同源性低，專一性高，大多尚未驗證在三萜皂苷通路中的酶活性，難以進行系統(tǒng)進化分析，是目前通路水平三萜皂苷研究的難點［20］。除了應用傳統(tǒng)的基因克隆方法外，還可以采用高通量測序的手段，對三萜皂苷合成通路及關鍵酶進行全面闡釋。例如在人參的轉(zhuǎn)錄組分析中，共發(fā)現(xiàn)了133個細胞色素P450和235個糖基轉(zhuǎn)移酶，其中有6個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶可能直接參與人參皂苷的合成［20］；在西洋參的轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了150個細胞色素P450和235個糖基轉(zhuǎn)移酶，其中有1個細胞色素P450和4個UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶可能直接參與皂苷的合成［21］。

雖然很多三萜苷元碳環(huán)骨架上復雜的修飾反應尚不清楚，但是通過對通路上游關鍵酶的分析，已經(jīng)具備了人工合成三萜苷元碳環(huán)骨架的理論基礎，增加了對三萜皂苷合成通路進化規(guī)律的認識。鯊烯合成酶所具有的2個高度保守區(qū)域可作為今后認定該類酶的重要依據(jù)，并發(fā)掘更多的三萜皂苷藥用資源。下一步研究的重點將是考察通路中不同基因的表達模式［23］，并且結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和代謝組，高通量地篩選藥用植物中的細胞色素P450和UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶，系統(tǒng)地比較不同修飾體的活性差異，探究其修飾規(guī)律，推進人工合成三萜皂苷的進程。

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Bioinformatics analysis of triterpenoid saponins biosynthesis pathway in herbalmedicines

ZHANG Zhao-bao1， HOU Lin1， CUIQing-hua1， PAN Qing1， MA Lu-yu2*
（1.College of Pharmacy，Shandong University of Traditional ChineseMedicine，Jinan 250300，China；2.Shandong Academy ofMedical Sciences，Jinan 250062，China）

AIMTo conductan informative analysis of key enzyme in biosynthesis pathway of triterpenoid saponins from herbalmedicines in the perspective of phylogenetics.METHODSFull protein sequences of squalene synthase，squalene epoxidase and 2，3-oxidosqualene cyclase，belonging to seventeen kinds of herbs，were downloaded from NCBIdatabase.Afterwards，analysis of physicaland chemical propertieswas conducted，conserved domain analysis，3D structures and Neighbor-Joining（NJ）phylogenetic analysis were carried out by bioinformatic softwares.RESULTSIt is shown that all the three enzymes were highly conservative.For squalene synthases，there were two completely conserved domains，Mg2+binding site with substrates，which were aspartic-rich and could be used as sequence tags.For squalene epoxidases and 2，3-oxidosqualene cyclases，their3D structureswere also highly conservative with few flexible random coils.CONCLUSIONThe upstream syntheses are highly conserved in evolution，the formation ofmany types of triperpenoid saponins may be associated with modification of downstream cytochrome P450，glycosyltranferases and beta-glucosidases.

triterpenoid saponin；squalene synthase；squalene epoxidase；2，3-oxidosqualene cyclase

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1255-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.021

2014-08-16

國家自然科學基金項目 （81273394）；“十二五”重大新藥創(chuàng)制國家科技重大專項 （2013ZX09103002-005）

張召寶（1988—），男，碩士，研究方向為中藥學。Tel：（0531）82919863，E-mail：zhangzhaobao2010@163.com

*通信作者：馬魯豫 （1972—），男，博士，副研究員，研究方向為中藥新藥開發(fā)。Tel：（0531）82919863，E-mail：maluyuyky@ 126.com