礞石滾痰丸中金胺O與金橙Ⅱ的檢測(cè)方法

吳嫣艷， 于倩茜

（1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210008；2.南京市江寧中醫(yī)院，江蘇南京211100）

［質(zhì)量］

礞石滾痰丸中金胺O與金橙Ⅱ的檢測(cè)方法

吳嫣艷1， 于倩茜2

（1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇南京210008；2.南京市江寧中醫(yī)院，江蘇南京211100）

目的建立檢測(cè)礞石滾痰丸中2種染色劑 （金胺O與金橙Ⅱ）的方法。方法礞石滾痰丸70%乙醇提取，采用液質(zhì)聯(lián)用，高效液相色譜柱為Agela Venusil MP C18（4.6 mm×250 mm，5μm），流動(dòng)相A為0.02 mol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為430 nm（金胺O）和485 nm（金橙Ⅱ）。結(jié)果HPLC法金胺O在2.084～41.680μg/mL范圍內(nèi)、金橙Ⅱ在2.292～45.840μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，金胺O、金橙Ⅱ檢測(cè)限分別為1.202、0.444 ng，平均回收率為90.9%、94.3%；LC/MS/MS法金胺O、金橙Ⅱ檢測(cè)限分別為0.305、0.430 ng。結(jié)論本方法快速靈敏可靠，可用于礞石滾痰丸中金胺O與金橙Ⅱ的檢測(cè)。

礞石滾痰丸；液質(zhì)聯(lián)用；金胺O；金橙Ⅱ；非法添加

礞石滾痰丸為2013年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種，收載于 《中國(guó)藥典》2010年版一部，處方中含有金礞石、沉香、黃芩、熟大黃四味中藥。具有逐痰降火的功效，用于痰火擾心所致的癲狂驚悸，或喘咳痰稠、大便秘結(jié)。筆者針對(duì)安全性方面做了探索性研究。

近年來，用劣質(zhì)黃芩非法染色以改善外觀，提高售價(jià)現(xiàn)象在市場(chǎng)上屢見不鮮?？紤]到礞石滾痰丸處方中有黃芩，本實(shí)驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)采用HPLC、LC/MS/MS法建立了礞石滾痰丸中可能非法添加的2種染色劑 （金胺O、金橙Ⅱ） 的檢測(cè)方法［1-16］。本方法快速、準(zhǔn)確、靈敏、可靠，可用于礞石滾痰丸中可能非法添加金胺O、金橙Ⅱ的檢測(cè)。

1儀器與試劑試藥

1.1 儀器 Agilent 1260 HPLC；SHIMADZU LC-10AD HPLC；Agilent1100 Series LC/MSD Trap。

1.2 材料試劑 14批礞石滾痰丸為2013年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品，由江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院提供；金胺O對(duì)照品 （批號(hào)111770-201302）與金橙Ⅱ?qū)φ掌?（批號(hào)111769-200701）均來自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

乙腈，色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司；乙酸銨，色譜純，Sigma公司；水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 高效液相色譜法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Agela Venusil MP C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相A為0.02 mol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫（0～10 min，A相65%；10～11 min，A相65%→50%；11～18 min，A相50%；18～19 min，A相50%→75%；19～25 min，A相75%；25～27 min，A相75%→20%；27～36 min，A相20%；36～38 min，A相20%→65%；38～60 min，A相 65%）；體積流量為 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為430 nm（金胺O）、485 nm（金橙Ⅱ）；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10μL。各成分的理論塔板數(shù)均＞50 000，相鄰峰的分離度均＞1.5。對(duì)照品色譜圖及樣品典型色譜圖見圖1、圖2。

圖1 檢測(cè)波長(zhǎng)430 nm下的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram s by 430 nm

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取金胺O和金橙Ⅱ?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加70%乙醇制成質(zhì)量濃度各為20μg/mL的混合對(duì)照品溶液，即得。

圖2 檢測(cè)波長(zhǎng)485 nm下的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chrom atogram s by 485 nm

2.1.3 供試品溶液的制備 取礞石滾痰丸適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，加70%乙醇10 mL，超聲 （功率為135 W，頻率為42 kHz）提取20 min，12 000 r/min離心10 min，取上清液為供試品溶液。

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密稱取金胺O、金橙Ⅱ?qū)φ掌愤m量，加70%乙醇制成質(zhì)量濃度分別為2、4、10、20、30、40μg/mL的系列對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)所述色譜條件下分別進(jìn)樣10μL。以質(zhì)量濃度 （μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察數(shù)據(jù)Tab.1 Data of linear relation test

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液 （20 μg/mL），在“2.1.1”項(xiàng)所述色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果金胺O的RSD為0.32%、金橙Ⅱ的RSD為0.19%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 加樣回收試驗(yàn) 取礞石滾痰丸樣品適量，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，精密加入質(zhì)量濃度均為200μg/m L的金胺O、金橙Ⅱ混合對(duì)照品溶液1 mL，精密加入70%乙醇9 mL，超聲 （功率為135 W，頻率為42 kHz）提取20 min，12 000 r/min離心10min，取上清液，即得。測(cè)定并計(jì)算。結(jié)果平均回收率（n=6）金胺O為90.9%（RSD= 1.5%）、金橙Ⅱ?yàn)?4.3%（RSD=1.2%）。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份加樣回收供試品溶液分別于0、2、4、8、12、16、24 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果金胺O的RSD為0.83%、金橙Ⅱ的RSD為0.52%，表明溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.1.8 HPLC檢測(cè)限 取“2.1.4”項(xiàng)下最低濃度對(duì)照品溶液加70%乙醇逐步稀釋，按 “2.1.1”項(xiàng)所述色譜條件進(jìn)樣，信噪比大于3時(shí)，金胺O的檢測(cè)限為1.202 ng、金橙Ⅱ的檢測(cè)限為0.444 ng。

2.1.9 樣品測(cè)定 取礞石滾痰丸樣品按上述方法測(cè)定，結(jié)果14批樣品在金胺O、金橙Ⅱ?qū)φ掌繁Ａ魰r(shí)間處均未檢出相應(yīng)的色譜峰。

2.2 液質(zhì)聯(lián)用法

2.2.1 條件與參數(shù)

2.2.1.1 色譜條件 色譜柱采用Waters Xbridge Shield RP18柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動(dòng)相A為0.02 mol/L乙酸銨溶液，流動(dòng)相B為乙腈，梯度洗脫（0～10 min，A相65%；10～11 min，A相65%→50%；11～18 min，A相50%；18～20 min，A相50%→20%；20～30 min，A相20%；30～31 min，A相20%→65%；31～45 min，A相65%）；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為430 nm（金胺O）、485 nm（金橙Ⅱ）；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10μL。分流進(jìn)樣，分流比為4∶1。

2.2.1.2 質(zhì)譜參數(shù) ESI正負(fù)離子檢測(cè)模式（正離子模式檢測(cè)金胺O，負(fù)離子模式檢測(cè)金橙Ⅱ），霧化器35.0 psi（1 psi=6.895 kPa），干燥氣體積流量9.0 L/min，干燥氣溫度350℃，正離子裂解電壓0.80 V，負(fù)離子裂解電壓1.50 V，掃描范圍50～700 m/z。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 即 “2.1.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 即 “2.1.3”項(xiàng)下礞石滾痰丸供試品溶液。

2.2.4 測(cè)定結(jié)果 取對(duì)照品溶液和供試品溶液，按 “2.2.1”項(xiàng)下條件與參數(shù)進(jìn)樣，記錄質(zhì)譜圖。結(jié)果14批礞石滾痰丸均未檢出與金胺O、金橙Ⅱ?qū)φ掌芬恢碌馁|(zhì)譜峰。質(zhì)譜圖見圖3、圖4。

2.2.5 LC/MS/MS檢測(cè)限 將質(zhì)譜對(duì)照品溶液逐漸稀釋，用以確定方法的檢出限 （S/N＞3），金胺O檢測(cè)限為0.305 ng，金橙Ⅱ檢測(cè)限為0.430 ng。

3 討論

液質(zhì)聯(lián)用法試驗(yàn)時(shí)分別采用正離子與負(fù)離子方式檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)金胺O、金橙Ⅱ分別是正離子方式、負(fù)離子方式檢測(cè)靈敏、穩(wěn)定，故最終選擇金胺O采用正離子方式檢測(cè)，金橙Ⅱ采用負(fù)離子方式檢測(cè)。

圖3 質(zhì)譜圖ESI+Fig.3 LC/MS/MS chrom atogram s by ESI+

中藥材及中藥飲片是中成藥質(zhì)量的源頭，而目前染色藥材和飲片在市場(chǎng)上常有發(fā)現(xiàn)，勢(shì)必存在影響中成藥質(zhì)量的可能。為規(guī)范市場(chǎng)，保障人民群眾安全用藥，針對(duì)中成藥中非法添加染色劑的檢測(cè)方法研究十分必要。

本研究采用高效液相色譜法和液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，對(duì)礞石滾痰丸中是否含有金胺O、金橙Ⅱ進(jìn)行檢測(cè)，建立的方法快速簡(jiǎn)便準(zhǔn)確可靠，可為礞石滾痰丸的質(zhì)量控制提供參考。

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圖4 質(zhì)譜圖ESIFig.4 LC/MS/MS chromatogram s by ESI-

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Identification of auram ine O and orangeⅡin M engshi Guntan Pills

WU Yan-yan1， YU Qian-qian2
（1.Jiangsu Institute for Food and Drug Control，Nanjing 210008，China；2.Nanjing Jiangning Hospital of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 211100，China）

AIMTo establish a method for detecting two coloring agents（auramine O and orangeⅡ）in Mengshi Guntan Pills.METHODSThe determination of70%ethanolic extractofMengshiGuntan Pillswasperformed on HPLC and LC/MS/MSmethod.Their column was Agela VenusilMPC18（4.6 mm×250 mm，5μm）with 0.02 mol/L ammonium acctate as mobile phase A and acetonitrile as mobile phase B in a gradient elution manner.The wavelength detection was430 nm for auramine O and 485 nm for orangeⅡ.RESULTSAuramine O and orangeⅡin HPLC chromatogram showed good linearity in the range of 2.084-41.680μg/mL and 2.292-45.840μg/mL，their detection's limits of auramine O and orangeⅡwere 1.202 ng and 0.444 ng，their average recoveries were 90.9%and 94.3%，respectively.The detection's limits of auramine O and orangeⅡin LC/MS/MSwere 0.305 ng and 0.430 ng，respectively.CONCLUSIONThemethod is rapid，sensitive and reliable，and it can be used for the determination ofMengshi Guntan Pillswith adulteration-auramine O and orangeⅡ.

：MengshiGuntan Pills；LC/MS/MS；auramine O；orangeⅡ；adulteration

R927.2

：A

：1001-1528（2015）06-1232-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.016

2014-07-03

吳嫣艷 （1984—），女，主管藥師，碩士，從事中藥質(zhì)量研究。Tel：（025）86632807，E-mail：21724604@qq.com