響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞肽類物質(zhì)提取條件

王明希， 雷海民

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102）

響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞肽類物質(zhì)提取條件

王明希， 雷海民*

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京100102）

目的探討響應(yīng)面Box-Behnben中心組合方法優(yōu)化瓜蔞中肽類物質(zhì)的提取。方法運用單因素實驗方法確定提取過程中超聲溫度、超聲時間、料液比等3個主要影響因素。在此基礎(chǔ)上二次多項回歸方程的ANOVA分析。結(jié)果

瓜蔞；肽類物質(zhì)；響應(yīng)曲面法

瓜蔞古稱栝樓，是葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.或雙邊栝樓T.rosthornii Harms的干燥成熟果實，主要分布于我國華南和西南地區(qū)。瓜蔞具有寬胸散結(jié)、潤燥滑腸、清熱滌痰等功效，為治療胸痹的要藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究，其可抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗血小板凝聚，且對肝損傷、心腦血管損傷有保護(hù)作用［1-3］。但是在2010年版 《中國藥典》中瓜蔞的質(zhì)量控制還停留在浸出物的測定階段，無成分定量測定［4］。因此，對瓜蔞有效成分的進(jìn)一步探索，便顯得尤為重要。

肽（peptide）是由氨基酸的胺基 （-NH2）和羧基（-COOH）脫水縮合形成肽鍵后，形成的鏈狀分子。隨著肽類物質(zhì)研究的深入，從中藥中分離出具有提高免疫、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、降脂降壓等活性的肽類成分的報道日益增多［5-6］。一些研究也報道了瓜蔞中肽類物質(zhì)的抗癌活性與使核糖體失活的作用［7-8］。因此，本實驗探討了響應(yīng)面法優(yōu)化瓜蔞中肽類物質(zhì)的提取工條件，為其活性物質(zhì)的分離、純化、藥理活性探究打下堅實的基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

FA2104S型電子分析天平 （上海光學(xué)儀器一廠）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗儀 （北京醫(yī)療設(shè)備二廠）；TDL-5-A CENTRZFUGE高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；R-1001-VN旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；JP-800B-8D型萬能粉碎機(jī) （久品工貿(mào)有限公司）。R13010042、R13010043 pH精密試紙 （上海楚柏實驗室設(shè)備有限公司）。

瓜蔞產(chǎn)于山西省運城市新絳縣，購于同仁堂，由北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為栝樓T.kirilowii Maxim的干燥成熟果實。經(jīng)曬干、切絲。

2 方法與結(jié)果

2.1 肽類物質(zhì)的提取 將瓜蔞飲片粉碎，過40目篩。石油醚脫脂 （石油醚與瓜蔞粉末的比例為1∶4，脫脂4次，每次4 h），將脫脂后的瓜蔞粉末于通風(fēng)陰涼處放置12 h，待用。精密稱取瓜蔞粉末20 g于燒杯中，加入一定量去離子水，并且調(diào)節(jié)溶液pH值為8.4。將盛有樣品的燒杯置于超聲清洗儀中，超聲頻率為200 W。超聲時間按照實驗條件分別取50、60、70 min，離心 （3 500 r/min，15 min）取上清液，待用。再用1 mol/L的鹽酸將上清液的pH值梯度調(diào)節(jié)到8.0、7.6、7.2、6.8、6.4、6.0、5.6、5.2，每一梯度均離心 （3 800 r/min，5 min）取沉淀，用相應(yīng)的pH值溶液洗滌2～3次。將上述8份沉淀合并于燒杯中加入于沉淀同體積的去離子水，并將溶液pH值調(diào)節(jié)為7.0，沉淀溶解，呈澄清溶液，待用作為樣品液。肽類物質(zhì)的鑒定方法為 （1）雙縮脲反應(yīng)：取樣品液2 mL于試管中加等體積雙縮脲試劑，溶液由無色變?yōu)樽仙?（2）考馬斯亮藍(lán)反應(yīng)：取考馬斯亮藍(lán)試劑2 mL于試管中，滴加樣品液，溶液迅速由紅色變?yōu)樗{(lán)色。說明此樣品液中，含有肽類物質(zhì)；糖類物質(zhì)的去除方法為 （1）苯酚-硫酸法：取樣品液5 mL于試管中加苯酚-硫酸試劑，無橙黃色化合物生成。（2）二硝基水楊酸法：取樣品液5 mL于試管中加二硝基水楊酸試劑，無棕紅色。表明糖類物質(zhì)，除去效果較好。將樣品液置于冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥，待用。以此肽類物質(zhì)粗提物的質(zhì)量和原料質(zhì)量比計算提取率。

2.2 單因素試驗

2.2.1 超聲溫度對提取率的影響 固定超聲時間為60 min，料液比為1/30，其他提取條件不變。超聲溫度分別取30、40、50、60、70℃，每個溫度點各做3次平行實驗。此5個溫度條件對應(yīng)的提取率為 13.36、41.32、52.11、47.99、26.81 mg/g。在50℃時提取效果最好。隨著溫度升高，分子熱運動增強(qiáng)，促進(jìn)肽類物質(zhì)溶出，提取效率增加。但是溫度過高會導(dǎo)致肽類物質(zhì)變性，隨雜質(zhì)離心去除。

2.2.2 超聲時間對提取率的影響 固定超聲溫度為50℃，料液比為1/30，其他提取條件不變。超聲時間分別取40、50、60、70、80 min，每個時間點各做3次平行實驗。此5個不同超聲時間對應(yīng)的提取率為 20.11、44.72、53.12、46.09、22.78 mg/g。在60 min時提取效果最好。適當(dāng)?shù)某晻r間，使肽類物質(zhì)的在藥材內(nèi)與提取中達(dá)到動平衡，促進(jìn)溶出。但過長時間處于50℃環(huán)境中，也可能導(dǎo)致肽類物質(zhì)變性沉淀，耐高溫雜質(zhì)大量溶出，影響提取率。

2.2.3 料液比對提取率的影響 固定超聲時間為60 min，超聲溫度為50℃，其他提取條件不變。料液比分別取1/10、1/20、1/30、1/40、1/50，每個料液比各做3次平行實驗。此5個料液比條件對應(yīng)的提取率為 9.32、21.22、49.56、30.32、18.02 mg/g。在1/30時提取效果最好。加提取液初期，水量較少時，瓜蔞粉末中果膠類、多糖類、纖維素吸水膨脹使溶液整體呈果凍狀，肽類被包裹，溶出較少。隨水量增大，而提取率增高。但是從料液比達(dá)到1∶30時提取率下降。料液比較大，大量肽類分散于提取液中，導(dǎo)致肽類物質(zhì)在下一步離心、酸沉過程中，損失較多。

2.3 響應(yīng)曲面法優(yōu)化瓜蔞肽類物質(zhì)的試驗設(shè)計與結(jié)果 本次實驗選用了響應(yīng)曲面法中的Box-Behnben中心組合方法建立試驗?zāi)Ｐ?，在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇超聲溫度 （A），超聲時間（B），料液比 （C）3個主要因素作為自變量，瓜蔞中肽類物質(zhì)的提取率作為響應(yīng)值。設(shè)計了3因素3水平的試驗?zāi)Ｐ汀Ｔ囼炘O(shè)計見表1。

將試驗數(shù)據(jù)運用Design Expert 8.0.6.1進(jìn)行多元回歸擬合，得出本次實驗因變量瓜蔞肽類物質(zhì)的提取率 （Y）與3個自變量超聲溫度 （A），超聲時間 （B），料液比 （C）的二次多項回歸方程如下：

Y=-505.3+8.810A+9.475B+2.930C-9.625E-0.030AB+0.019AC+0.020BC-0.085A2-0.079B2-0.085C2

此二次多項回歸方程的ANOVA分析表，見表2。模型的F值為270.27，P＜0.000 1，有顯著差異，證明造模成功。失擬項為0.074 5，沒有顯著差異，證明模型的失擬程度不大。R2為0.997 1表示模型的模擬程度較好良好。

表1 Box-Behnben中心組合方法試驗設(shè)計及結(jié)果Tab.1 Box-Behnken test design and results

表2 二次多項回歸方程的ANOVA分析Tab.2 Significance test resu lts of regression equation

3個自變量超聲溫度 （A），超聲時間 （B），料液比 （C）的交互作用可通過3D圖形、等高線圖顯現(xiàn)出來，見圖1。

通過對比分析三個因素的等高線圖與響應(yīng)面圖，可見三種因素之間的交互作用均較明顯，坡面均較陡，呈鐘罩型。其中超聲溫度 （A）與超聲時間 （B）的響應(yīng)面最陡，等高線間距小，對提取率的影響最大。

通過Design Expert軟件的Box-Behnben中心組合法極值求解，可得瓜蔞中肽類物質(zhì)的最佳提取工藝為：超聲溫度52℃，超聲時間61 min，料液比為1/30。預(yù)測最高提取率為53.70 mg/g。

2.4 驗證試驗 根據(jù)響應(yīng)面分析法得出的最優(yōu)工藝，簡化實驗條件為超聲溫度52℃，超聲時間61 min，料液比為1/30對瓜蔞中肽類物質(zhì)進(jìn)行提取，水平重復(fù)5次，得肽類物質(zhì)的平均提取率為53.60 mg/g（RSD=2.845%）。與預(yù)測值較為吻合。

3 討論

雖然種子類蛋白物質(zhì)的提取工藝，已有大量文獻(xiàn)［9-10］報道。但是含糖、油脂量較大的中藥飲片中的肽類物質(zhì)提取工藝，卻鮮有報道。瓜蔞飲片為果實類藥材，含有大量的果膠、多糖、纖維素、肽類、油脂類化合物等。不同于以往中藥化學(xué)研究領(lǐng)域中的黃酮、生物堿等小分子活性物質(zhì)，這些生物大分子在溶出過程中均以膠體形式存在，物理、化學(xué)性質(zhì)相似，大大增加了肽類物質(zhì)的提取難度。尤其是，至今尚未有多糖與肽類物質(zhì)的各自保持活性的通用分離方法。Sevag法雖然可以使肽類物質(zhì)從混合溶液中沉淀出來，但肽類物質(zhì)因接觸氯仿、三氯醋酸，并經(jīng)過劇烈振搖，已喪失活性。生物化學(xué)領(lǐng)域較為成熟的動物蛋白提取方法，會嚴(yán)重造成肽類種類的缺失，均不適合照搬應(yīng)用于中藥材的研究過程中。

肽類物質(zhì)在提取過程中極易變性沉淀，造成提取效率下降，有效物質(zhì)活性降低。易使其變性的化學(xué)條件有強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬鹽、有機(jī)試劑等；易使其變性的物理方法有加高溫、紫外線照射、劇烈振蕩或攪拌等。提取條件些許的變化即可嚴(yán)重影響肽類物質(zhì)的提取率。本次實驗，提取條件均能較溫和，pH選用范圍小，經(jīng)堿提酸沉后，沉淀復(fù)溶為澄清溶液，表示沒有破壞其空間結(jié)構(gòu)。提取過程中無需長期高溫加熱，沒有使用有機(jī)試劑，很好的保持了瓜蔞肽類物質(zhì)的活性。料液比、超聲時間、超聲溫度三個提取條件的適宜選擇，使肽類物質(zhì)的提取率顯著增加。

響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）可以分析因變量與多個自變量間的回歸關(guān)系，多用二項式回歸方程進(jìn)行統(tǒng)計結(jié)果的表達(dá)。其可將自變量與因變量的函數(shù)關(guān)系用3D圖形展示出來，結(jié)果直觀、簡潔［11-12］。Box-Behnben中心組合法試驗方案中沒有將所有試驗因素同時安排為高水平的試驗組合，可以安全、有效的指導(dǎo)試驗進(jìn)行，已被廣泛使用［13-14］。這種方法尤其適用于多因素交叉影響產(chǎn)率的實驗，因此，我們選用了響應(yīng)曲面法中Box-Behnben中心組合方法首次建立提取瓜蔞中肽類物質(zhì)的實驗?zāi)Ｐ?，對其提取條件進(jìn)行了合理優(yōu)化。

本次實驗運用響應(yīng)曲面法得出最佳提取工藝為：超聲溫度52℃，超聲時間61 min，料液比為1/30.04。預(yù)測最高提取率為53.70 mg/g。最優(yōu)工藝條件下實際肽類物質(zhì)的平均提取率為53.60 mg/g。與預(yù)測值較為吻合。綜上，響應(yīng)曲面法可準(zhǔn)確優(yōu)化瓜蔞肽類物質(zhì)的提取工藝，為含糖、油脂量較大的中藥飲片的肽類物質(zhì)提取工藝的研究發(fā)展，提供了可靠參考。

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Response surfacemethodology for optim ization of the extraction of peptides from Trichosanthes kirilowii M axim.

WANGMing-xi， LEIHai-min*
（School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Trichosanthes kirilowii Maxim.；peptides；response surfacemethodology

R284.1

：A

：1001-1528（2015）06-1221-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.014

2014-07-17

國家自然科學(xué)基金項目 （81173519）；北京中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊資助項目 （2011-CXTD-15）

王明希 （1990—），女，碩士，研究方向為中藥活性寡肽分析分離方法的構(gòu)建。Tel：18511896085，E-mail：wmx6085@ 126.com

*通信作者：雷海民（1968—），男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥活性寡肽分析分離方法的構(gòu)建。E-mail：leihaimin@126.com

瓜蔞肽類物質(zhì)的最佳提取條件為：超聲溫度52℃，超聲時間61 min，料液比為1/30。在此條件下，瓜蔞中肽類物質(zhì)預(yù)測最高提取率為53.70mg/g。實驗驗證值為53.60mg/g。結(jié)論瓜蔞肽類物質(zhì)的提取時的實際值與響應(yīng)曲面法預(yù)測值較為接近。