刺五加注射液在正常大鼠與腦缺血-再灌注損傷疾病大鼠體內(nèi)藥動學比較

范惠霞， 鄧志鵬， 王福文， 徐曉婷， 姚慶強*

（1.山東省醫(yī)學科學院藥物研究所，山東濟南250062；2.濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東濟南250022；3.山東省罕少見病重點實驗室，山東濟南250062）

刺五加注射液在正常大鼠與腦缺血-再灌注損傷疾病大鼠體內(nèi)藥動學比較

范惠霞1，2，3， 鄧志鵬1，3， 王福文1， 徐曉婷1，2，3， 姚慶強1，3*

（1.山東省醫(yī)學科學院藥物研究所，山東濟南250062；2.濟南大學山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院，山東濟南250022；3.山東省罕少見病重點實驗室，山東濟南250062）

目的比較刺五加注射液 （紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶等）在正常大鼠與腦缺血-再灌注損傷大鼠體內(nèi)藥代動力學行為。方法采用longa法建立大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷疾病模型，采用液相色譜-串聯(lián)四級桿質(zhì)譜法測定不同時間點大鼠血漿中紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶的含有量，用藥代動力學軟件DAS 2.0非房室模型計算藥動學參數(shù)并用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對主要藥動學參數(shù)進行比較。結(jié)果與正常大鼠體內(nèi)藥動學相比較，腦缺血-再灌注損傷對刺五加注射液中紫丁香苷產(chǎn)生蓄積，對異嗪皮啶的消除發(fā)生改變，對刺五加苷E無影響。結(jié)論初步推測腦缺血-再灌注損傷大鼠體內(nèi)，紫丁香苷及異嗪皮啶與血漿蛋白結(jié)合能力發(fā)生改變，有待進一步研究。

腦缺血-再灌注損傷；大鼠；五加注射液；紫丁香苷；刺五加苷E；異嗪皮啶；藥動學

刺五加注射液是刺五加經(jīng)過提取制得的滅菌注射液，在我國臨床用于治療心腦血管疾病已經(jīng)多年，主要用于肝腎不足所致的短暫性腦缺血發(fā)作、腦動脈硬化、腦血栓形成、腦栓塞等。紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶是刺五加的主要活性成分，也是刺五加注射液發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎，具有廣泛的藥理活性［1-4］。研究表明，刺五加提取物可減緩大鼠大腦海馬趾CA1區(qū)神經(jīng)死亡，減弱腦缺血-再灌注引起的COX-2，GFAP及OX-42因子的活化，實現(xiàn)對腦缺血大鼠的神經(jīng)保護作用［5］。此外，刺五加苷B、E可通過抑制iNOS活性，減少一氧化氮生成，減少缺血性神經(jīng)元凋亡［6］。上述研究表明，紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶可能在刺五加注射液治療缺血性腦血管疾病時發(fā)揮重要作用。

目前，已有文獻報道刺五加注射液中紫丁香苷、刺五加苷E在大鼠體內(nèi)的藥代動力學研究［7-8］。然而，該研究主要局限于正常大鼠體內(nèi)，對病理狀態(tài)大鼠體內(nèi)的藥動學研究未見報道。為進一步明確刺五加注射液的藥動學，更好地指導臨床用藥，本課題組對刺五加注射液中3個主要活性成分在腦缺血-再灌注損傷大鼠體內(nèi)的藥代動力學行為進行研究，比較刺五加注射液中主要有效成分在正常大鼠及腦缺血-再灌注損傷大鼠體內(nèi)藥動學行為差異。

1 儀器與試藥

1.1 試藥與試劑 紫丁香苷 （LPZ022）、刺五加苷E（LPC031）、異嗪皮啶 （LPQ069）、牡荊苷（內(nèi)標物質(zhì)LPM041），均購自沈陽瀧浦科技有限公司，純度＞98%；刺五加注射液 （批號20120112，規(guī)格250 mL/支，黑龍江烏蘇里江制藥有限公司），并采用高效液相色譜法測定其中紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶的質(zhì)量濃度，結(jié)果分別為139.9、126.6、13.6μg/m L。色譜級甲醇（美國TEDIA公司）；色譜級乙腈（美國Burdick&Jackson公司）；其他試劑均為分析純 （國藥集團化學試劑有限公司）；水為娃哈哈純凈水。新鮮大鼠空白血漿為本實驗自制。

1.2 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀、Agilent 6410三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀 （美國安捷倫公司）；氮氣濃縮儀 （北京普利泰科技儀器有限公司）；TGL-16G高速臺式離心機、SK-1快速混勻器渦流混懸儀 （常州澳華儀器有限公司）；KQ5200型超聲波清洗儀 （昆山市超聲波儀器有限公司）。

1.3 動物 雄性健康Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量220～250 g，由山東中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，合格證號 SCXK（魯）2011-0003。實驗前于本室動物房飼養(yǎng)10 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。

2 實驗方法

2.1 大鼠腦缺血-再灌注損傷模型的建立 12只大鼠隨機分為模型組與正常組。模型組大鼠參照longa［9］法，用2.5%戊巴比妥鈉（25 mg/kg）腹腔注射麻醉，使其在手術臺仰臥固定，切開頸部正中皮膚，鈍性分離出右頸總動脈及分支和頸內(nèi)、外動脈，穿線結(jié)扎頸外動脈，進而分離并結(jié)扎頸內(nèi)動脈進耳分支。在頸總動脈 （近內(nèi)、外頸動脈分叉處）上作一小切口，由此沿頸內(nèi)動脈插入一根頭端加工成圓珠狀 （直徑＜0.30 mm）尼龍線，插入約17 mm（由頸內(nèi)、外動脈分叉處起算），用縫線固定尼龍線，造成局灶性大腦中動脈梗塞，記錄梗塞時間。該模型成功的標志為大鼠蘇醒后出現(xiàn)同側(cè)Homer征和對側(cè)以前肢為重的偏癱。2 h后輕輕提拉出插線，實現(xiàn)對缺血腦組織的再灌注，結(jié)扎殘端并逐層縫合肌肉、皮膚。

2.2 給藥及血樣采集 模型組大鼠實現(xiàn)再灌注后立即經(jīng)尾靜脈注射刺五加注射液（10 mL/kg），正常組大鼠按同等劑量給藥。分別于給藥后2、5、10、15、20、30、40、60、90、120、150、180 min眼底靜脈叢取血約300μL，置于肝素抗凝管中。經(jīng)8 000 r/min離心5 min，取上清液，置于-20℃冷凍保存待測。

2.3 測定條件

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6mm× 150 mm，5μm）；流動相為甲醇（A相）-0.1%甲酸水溶液 （B相），梯度洗脫（0～4.0 min，A相20%～70%；4.0～12.0 min，A相70%）；體積流量0.6 mL/min；進樣量20μL，柱溫30℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源 （ESI），多反應監(jiān)測模式（MRM），正負離子同時監(jiān)測；紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶及牡荊苷 （內(nèi)標）的監(jiān)測離子對分別為m/z 395.0/232.0、765.1/765.1、223.0/162.0、431.0/311.1，優(yōu)化的碎裂電壓分別為150、150、135、150V；碰撞能量分別為20、0、25、20 eV；毛細管電壓 （±）4.0 kV；干燥氣體積流量10 L/min；干燥氣溫度325℃；霧化氣壓力35 psi；碰撞氣為高純氮氣，壓力0.15MPa。

2.4 血漿樣品的處理 50μL血漿樣品，依次加入50μL內(nèi)標溶液 （1.0μg/mL），50μL乙腈作為沉淀試劑，渦流混合1 min，于1.2×104r/min條件下離心5 min，取上清液進行測定。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 取7份180μL的空白血漿，置離心管中并加入不同質(zhì)量濃度梯度混合對照品溶液 （紫丁香苷、刺五加苷E質(zhì)量濃度為30.0、100.0、300.0、1 000.0、3 000.0、10 000、30 000 ng/m L，異嗪皮啶質(zhì)量濃度為10.0、30.0、100.0、300.0、1 000.0、3 000.0、10 000 ng/mL）各20μL，制成含有紫丁香苷、刺五加苷E質(zhì)量濃度為3.0、10.0、30.0、100.0、300.0、1 000、3 000 ng/m L；異嗪皮啶質(zhì)量濃度為1.0、3.0、10.0、30.0、100.0、300.0、1 000 ng/mL的含藥血漿樣品。將含藥血漿按 “2.4”項下樣品處理方法處理并進樣測定。以目標化合物與內(nèi)標化合物峰面積之比y為縱坐標，進樣質(zhì)量濃度x（ng/m L）為橫坐標進行線性回歸，權重因子選擇1/x2。

2.5.2 精密度與準確度 取18份空白血漿180μL，分為3組，每組6樣本。向每組中分別加入3種不同質(zhì)量濃度的混合對照品溶液 （紫丁香苷、刺五加苷 E質(zhì)量濃度為 100.0、1 000.0、27 000 ng/mL；異嗪皮啶質(zhì)量濃度為 300.0、3 000.0、9 000 ng/mL）20μL，制成含有紫丁香苷、刺五加苷E質(zhì)量濃度為10.0、100.0、2 700 ng/mL；異嗪皮啶質(zhì)量濃度為3.0、30.0、900 ng/mL的低、中、高3種質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品。將質(zhì)控血漿樣品按 “2.4”項下樣品處理方法處理，進樣測定，計算日內(nèi)精密度 （RSD）。如此操作，連續(xù)測定3 d。計算日間精密度。綜合上述測定結(jié)果，計算準確度（RE）。

2.5.3 回收率 按 “2.5.2”項下制備含有紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶的低、中、高3種質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品各3份。將質(zhì)控血漿樣品按“2.4”項下處理方法處理，進樣測定記錄峰面積（用A表示）；取50μL大鼠空白血漿9份，分為3組，每組3樣本，分別加入100μL乙腈沉淀蛋白，取全部上清液經(jīng)氮氣吹干。分別向每組加入低、中、高3種質(zhì)量濃度 （紫丁香苷、刺五加苷E質(zhì)量濃度為10.0、100.0、2 700 ng/mL；異嗪皮啶質(zhì)量濃度為3.0、30.0、900 ng/mL）的混合對照品溶液50μL，內(nèi)標50μL，乙腈50μL。經(jīng)超聲、渦流、離心后，取上清液進樣分析，記錄被分析物及內(nèi)標的峰面積（用B表示）；另取50μL純水9份，分為3組，每組3樣本，加入100μL乙腈渦流離心，氮氣吹干。分別依次加入低、中、高3種質(zhì)量濃度混合對照品溶液50μL，內(nèi)標溶液50μL，乙腈50μL，經(jīng)超聲、渦流、離心后，取上清液進樣測定，記錄被分析物及內(nèi)標的峰面積 （用C表示）。計算A/B，得目標化合物及內(nèi)標的回收率；計算A/C比值，得基質(zhì)效應。

2.6 血藥濃度的測定及數(shù)據(jù)處理 參照血漿樣品處理方法處理，采用測定條件依法測定，按當日標準曲線計算各時間點內(nèi)的血藥濃度。所得血藥濃度采用DAS 2.0軟件進行擬合，擬合得到的參數(shù)采用SPSS 17.0組間t檢驗進行比較，以P＜0.05為顯著性差異判斷標準。

3 結(jié)果

3.1 色譜行為 大鼠空白血漿、空白血漿加目標化合物的對照品及內(nèi)標及正常大鼠、模型大鼠給藥后血漿的色譜圖如圖1。由圖可知，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標化合物及內(nèi)標化合物的測定。

圖1 紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶及內(nèi)標牡荊苷的色譜圖Fig.1 MRM chromatogram s of syringin，eleutheroside E，isofraxidin，and vitexin

3.2 方法學考察

3.2.1 線性范圍及最低定量下限 以目標化合物與內(nèi)標化合物峰面積之比y為縱坐標，進樣質(zhì)量濃度x（ng/mL）為橫坐標進行線性回歸，紫丁香苷、刺五加苷E、異嗪皮啶線性回歸方程分別為y= 0.001 30 x+0.002 25（r=0.996 2）；y= 0.007 48 x+0.007 59（r=0.995 1）；y= 0.000 89 x+0.003 67（r=0.999 4）。紫丁香苷、刺五加苷 E及異嗪皮啶分別在3.00～3 000、3.00～3 000、1.00～1 000 ng/mL范圍內(nèi)線性關系良好。目標化合物的最低定量下限為3.00、3.00、1.00 ng/mL。

3.2.2 精密度與準確度 低、中、高3個質(zhì)量濃度下，紫丁香苷日內(nèi)RSD≤7.3%，日間RSD≤14.4%；刺五加苷E日內(nèi)RSD≤8.2%，日間RSD≤11.5%；異嗪皮啶日內(nèi)RSD≤6.4%，日間RSD≤10.5%。3種質(zhì)量濃度下紫丁香苷RE≤ 6.0%，刺五加苷E RE≤8.6%，異嗪皮啶RE≤10.1%，表明該方法日內(nèi)、日間精密度及準確度良好，滿足方法學要求。

3.2.3 回收率及基質(zhì)效應 低、中、高3個質(zhì)量濃度下，紫丁香苷的提取回收率分別為 （82.5± 7.3）%、（82.3±4.5）%、（84.5±2.3）%；刺五加苷E的提取回收率分別為 （70.3±5.9）%、（70.8±2.6）%、（73.7±2.8）%；異嗪皮啶的提取回收率分別為 （81.2±14.3）%、（80.8± 4.3）%、（83.3±2.1）%；內(nèi)標化合物的提取回收率為 （88.0±6.8）%。表示回收率良好，滿足樣品測定要求。血漿基質(zhì)對各質(zhì)量濃度項下目標化合物具有微弱的離子增強效應，但均小于 （109.5± 4.3）%，對內(nèi)標牡荊苷具有微弱的離子抑制作用，為（90.9±1.9）%。

3.3 藥代動力學實驗結(jié)果 正常大鼠及模型組大鼠尾靜脈注射刺五加注射液后，紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶的藥-時曲線見圖2。擬合得到的主要藥動學參數(shù)見表1。得到的藥動學參數(shù)通過SPSS 17.0組間t檢驗進行組間比較。在疾病模型大鼠體內(nèi)，紫丁香苷的藥-時曲線下面積［AUC（0→∞）］為 （979.5±224.3）（μg·h）/L，較正常大鼠體內(nèi)（692.7±71.5）（μg·h）/L顯著增大；清除率 （CL）為 （1.5±0.3） （L·kg）/h，較正常組顯著減小；半衰期 （t1/2）為 （0.7± 0.4）h，與正常組保持一致。異嗪皮啶AUC（0→∞）為（26.3±7.8） （μg·h）/L；CL為（5.5±1.6）（L·kg）/h，與正常組無顯著性差異；t1/2（0.17±0.06）h，較正常組（0.11±0.01）h顯著延長。刺五加苷E在疾病模型大鼠體內(nèi)的AUC（0→∞）為 （1 421.9±360.5）（μg·h）/L；CL為（0.9±0.3）（L·kg）/h；t1/2為 （0.7±0.5）h，與正常組相比無顯著性差異。

圖2 刺五加注射液中紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶在正常大鼠及腦缺血-再灌注損傷大鼠體內(nèi)的半對數(shù)血藥濃度-時間曲線Fig.2 Sem i-logarithm ic concentration-time curves for syringin，eleutheroside E，and isofraxidin in norm al and model（cerebral ischem ia-reperfusion）rats

表1 紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶的在正常組大鼠及模型組大鼠體內(nèi)的主要藥動學參數(shù)Tab.1 M ain pharm acokinetics parameters for syringin，eleu theroside E，and isofraxidin in normal and model rats

4 討論

為考察刺五加注射液在腦缺血-再灌注損傷疾病大鼠體內(nèi)的藥動學行為，必須選擇與臨床接近的動物模型。大腦中動脈閉塞造成的局灶性腦缺血是臨床常見的缺血性腦血管疾?。?0］。本研究采用改良Longa法，使用尼龍魚線閉塞大鼠大腦中動脈建立局灶性腦缺血模型，缺血2 h后恢復血流灌注。該方法操作簡單易行，避免開顱，動物損傷小，為后續(xù)的藥代動力學研究奠定良好的基礎。

本實驗采用LC-MS/MS法對血漿樣品中3個目標化合物進行定量。質(zhì)譜采用電噴霧離子源和多反應監(jiān)測模式，通過對目標化合物及內(nèi)標化合物進行全掃描、子離子掃描，確定紫丁香苷、異嗪皮啶及內(nèi)標化合物的監(jiān)測離子對分別為m/z395.0/232.0、223.0/162.0、431.0/311.1。將刺五加苷E進行全掃描，選擇豐度較高的［M+Na］+（m/z 765.1）峰作為刺五加苷E的母離子，對母離子做子離子掃描時發(fā)現(xiàn)，無論施加多大碎裂電壓及碰撞能量，仍難以裂解，因而同時選用m/z765.1的離子作為刺五加苷E的子離子，確定其監(jiān)測離子對為765.1/765.1。

藥代動力學研究結(jié)果顯示，刺五加注射液中紫丁香苷及異嗪皮啶在疾病模型大鼠體內(nèi)藥動學行為發(fā)生改變，刺五加苷E的藥動學行為與正常大鼠體內(nèi)保持一致。3個有效成分在疾病模型大鼠及正常大鼠體內(nèi)的藥動學差異，是其在大鼠體內(nèi)分布、代謝及排泄過程綜合作用的結(jié)果。由半對數(shù)血藥濃度-時間曲線圖可以看出，較正常組，紫丁香苷在腦缺血疾病模型大鼠體內(nèi)發(fā)生蓄積，而異嗪皮啶在模型大鼠體內(nèi)的消除發(fā)生改變。研究顯示，紫丁香苷及異嗪皮啶可與血漿蛋白結(jié)合［11-12］實現(xiàn)其在大鼠體內(nèi)的分布及轉(zhuǎn)運。初步推測腦缺血-再灌注損傷大鼠體內(nèi)，紫丁香苷及異嗪皮啶與血漿蛋白結(jié)合能力發(fā)生改變，從而使紫丁香苷及異嗪皮啶在疾病大鼠體內(nèi)的藥動學行為發(fā)生改變。另有研究表明［13-15］，腦缺血-再灌注損傷使得大鼠體內(nèi)某些代謝酶的活性降低，生物膜轉(zhuǎn)運能力下降，也可能是造成紫丁香苷及異嗪皮啶在模型大鼠體內(nèi)藥動學行為差異的原因。靜脈注射給藥后，紫丁香苷及異嗪皮啶主要經(jīng)尿液排泄，而腦缺血再灌注損傷引起血液流經(jīng)腎的血流量減少，可能使得兩目標化合物經(jīng)尿液排泄減少，因而推測可能造成紫丁香苷及異嗪皮啶藥動學行為的改變［16］。至于病理狀態(tài)下機體對紫丁香苷及異嗪皮啶的處置機制及過程，有待進一步研究。

該項研究表明，藥物在疾病狀態(tài)機體內(nèi)的藥代動力學行為發(fā)生改變。對臨床應用而言，病理狀態(tài)下獲得的藥動學參數(shù)對于指導臨床用藥更有意義。本實驗以紫丁香苷、刺五加苷E及異嗪皮啶3種不同結(jié)構的活性成分為指標，初步探索刺五加注射液在腦缺血-再灌注損傷疾病大鼠體內(nèi)的藥代動力學行為，為刺五加注射液臨床安全用藥提供理論依據(jù)。

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Com paring pharmacokinetics of Acanthopanax Injection in normal and cerebral ischem ia-reperfusion rats

FAN Hui-xia1，2，3， DENG Zhi-peng1，3， WANG Fu-wen1， XU Xiao-ting1，2，3， YAO Qing-qiang1，3*
（1.Institute of Materia Medica，Shandong Academy of Medical Sciences，Jinan 250062，China；2.Schoolof Medicineand Life Sciences，University of Jinan and Shandong Academy of Medical Science，Jinan 250022，China；3.Key Laboratory of Rareand Uncommon Diseases of Shandong Province，Jinan 250062，China）

AIMTo compare the pharmacokinetics of the normal and the cerebral ischemia-reperfusion rats given Acanthopanax Injection（syringin，isofraxidin，and eleutheroside E）intravenously.METHODSLonga method was for establishing the ratmodel with cerebral ischemia-reperfusion；high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）was for determination of the contents of syringin，isofraxidin，and eleutheroside E in rat plasma.The pharmacokinetic parameters and statistics were obtained through DAS 2.0 and SPSS softwares processing，respectively.RESULTSWhile eleutheroside E remained unchanged between the two groups，gradual in vivo syringin accumulation and elimination change of isofraxidin were observed in cerebral ischemia reperfusion rats，but not in normal rats.CONCLUSIONWe speculate from the study that the syringin and isofraxidin somehow combine with plasma proteins，but further study is needed.

cerebral ischemia-reperfusion；syringin；eleutheroside E；isofraxidin；pharmacokinetics

R969.1

：A

：1001-1528（2015）06-1215-07

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.013

2014-02-18

范惠霞（1988—），女，碩士，從事藥物分析研究。Tel：13156371500，E-mail：fan.hui.xia@163.com

*通信作者：姚慶強 （1965—），男，博士，研究員，碩士生導師，從事天然藥物化學與藥物分析研究。Tel：（0531）82919960，E-mail：yao_imm@163.com