復(fù)方廣金錢草提取工藝對(duì)大鼠利尿排石的影響

張 慧， 陳卓瀚， 陸海玲， 劉天竹，郭麗冰*， 黎行山， 陳艷芬

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東廣州510700）

復(fù)方廣金錢草提取工藝對(duì)大鼠利尿排石的影響

張 慧1， 陳卓瀚1， 陸海玲1， 劉天竹1，郭麗冰1*， 黎行山2， 陳艷芬1

（1.廣東藥學(xué)院中藥學(xué)院，廣東廣州510006；2.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東廣州510700）

目的觀察復(fù)方廣金錢草顆粒 （廣金錢草、車前子、黃芪、黨參、茯苓等組成）的水提取物、水提醇沉物和混合（部分水提，部分醇提）提取物的利尿排石作用。方法采用大鼠代謝籠法觀察復(fù)方廣金錢草不同工藝提取物的利尿作用，采用乙二醇和氯化銨誘導(dǎo)大鼠腎草酸鈣結(jié)石模型，連續(xù)給藥30 d后，觀察大鼠成石率和檢測(cè)各組大鼠尿草酸、尿鈣含量和腎組織勻漿中草酸和鈣的含量。結(jié)果復(fù)方廣金錢草顆粒不同提取物均能促進(jìn)大鼠排尿草酸和尿鈣，但水提醇沉物和混合提物比水提物作用更好。結(jié)論復(fù)方廣金錢草醇處理工藝對(duì)大鼠腎結(jié)石的形成產(chǎn)生抑制作用。

復(fù)方廣金錢草顆粒；水負(fù)荷試驗(yàn)；排石實(shí)驗(yàn)；大鼠

復(fù)方廣金錢草顆粒為12味中藥組成的復(fù)方制 劑，具有利水排石，清熱通淋等功效。該處方來源于廣州醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院的臨床驗(yàn)方，主要用于小結(jié)石的治療以及腎結(jié)石碎石后輔助排石，療效顯著。臨床上原以湯劑的形式入藥，但存在服用不方便、服用量大、攜帶不便、不易貯存等問題，故擬將其研制成顆粒劑。為將此方開發(fā)成六類中藥新藥，本實(shí)驗(yàn)觀察復(fù)方廣金錢草不同工藝提取物對(duì)大鼠的排石利尿藥效，以便確定該復(fù)方的提取工藝。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物 復(fù)方廣金錢草水提物 （8倍于藥材量水提取3次，提取液濃縮至1.24 g/mL）、復(fù)方廣金錢草水提醇沉物 （8倍于藥材量水提取3次，結(jié)合醇沉工藝除去部分水溶性雜質(zhì)，提取液濃縮至1.24 g/mL）、復(fù)方廣金錢草混合提取物 （廣金錢草、黃芪、黨參、車前子、茯苓、牛膝8倍量水提［1-5］3次，結(jié)合醇沉工藝除去部分水溶性雜質(zhì)，穿破石、冬葵子、路路通、甘草、瞿麥、澤瀉采用60%乙醇提取［6-10］2次，第1次8倍量，第2次6倍量，將水提醇沉液與醇提液合并后濃縮至1.24 g/mL）為實(shí)驗(yàn)室自制。廣金錢草、車前子、路路通等藥材均購(gòu)于廣州致信中藥飲片有限公司，由廣東藥學(xué)院李書淵教授鑒定，符合 《中國(guó)藥典》2010年版一部規(guī)定。五淋化石丸 （廣西梧州三鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)121003），氫氯噻嗪 （山西云鶴制藥有限公司，批號(hào)A130701）。

1.2 動(dòng)物 Wister大鼠，雄性，體質(zhì)量160～200 g，許可證號(hào)SCXK（粵）2011-0015，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.3 試劑 乙二醇 （天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)2014214），氯化銨 （天津市大茂化學(xué)試劑，批號(hào)2013516），鈣測(cè)試盒 （南京建成生物工程研究所，批號(hào)20140414），其他試劑均為分析純。

1.4 儀器 680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Biorad公司），紫外可見分光光度計(jì) （UV-2450），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（IKA.HB10Basic）。

2 方法

2.1 大鼠水負(fù)荷實(shí)驗(yàn) （代謝籠法）［11-12］選取160～200 g雄性大鼠50只，隨機(jī)分為5組，每組10只，空白組、水提組 （18.6 g/kg）、水提醇沉組（18.6 g/kg）、混合提取組（18.6 g/kg）、氫氯噻嗪組，灌胃給藥15 m L/kg，連續(xù)灌胃7 d。末次給藥前12 h禁食不禁水。給藥前1 h每組灌以生理鹽水20 mL/kg。開始給藥前輕輕下壓大鼠下腹部使其排空余尿，給藥后立即將大鼠放入代謝籠中，收集各組大鼠6 h的尿液，記錄尿量。

2.2 大鼠排石試驗(yàn) 選取160～200 g雄性大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只?？瞻捉M、水提組（18.6 g/kg）、水提醇沉組 （18.6 g/kg）、混合提取組（18.6 g/kg）、五淋化石丸組 （3 g/kg），灌胃給藥15 mL/kg，每天灌胃1次，連續(xù)30 d。在此期間，除空白對(duì)照組外，其余5組每天給大鼠自由飲用1%乙二醇水溶液、每天灌以2%氯化銨1 mL/100 g，以形成腎結(jié)石。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前一天將各組大鼠放入代謝籠，收集24 h尿液，記錄尿量，并對(duì)尿液pH、尿草酸、尿鈣進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)頸椎脫臼處死動(dòng)物，剖腹取出雙腎，左腎進(jìn)行病理學(xué)檢查，右腎勻漿后測(cè)腎草酸以及腎鈣含有量。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法

2.3.1 草酸根離子、鈣離子［13-16］應(yīng)用甲基麝香草酚藍(lán)比色法測(cè)定尿鈣及腎鈣，應(yīng)用鉻酸鉀氧化甲基紅催化光度法測(cè)定尿草酸及腎草酸含有量。

2.3.2 病理結(jié)果 大鼠脊椎脫臼法處死后稱重，剖腹摘取雙腎，縱向剖開左腎置于10%福爾馬林中固定，石蠟包埋。HE染色，于100倍光鏡下觀察有無明顯草酸鈣結(jié)晶沉淀物及游離結(jié)石或鈣化斑作為腎結(jié)石的判斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)結(jié)石形成的多少及腎臟損傷程度分為5級(jí)并進(jìn)行量化評(píng)分［17］，0分：腎皮質(zhì)、髓質(zhì)及腎乳頭均為無可見的結(jié)石和結(jié)晶沉淀物，腎臟外形無異常變化；1分：腎皮質(zhì)或髓質(zhì)可見少量散在結(jié)晶沉淀物；2分：腎皮質(zhì)、髓質(zhì)及腎盂可見結(jié)晶沉淀物或有小的游離結(jié)晶；3分：腎剖面可見較多結(jié)晶，并有游離結(jié)石形成，腎乳頭可見鈣化斑，腎盂擴(kuò)張積水；4分：腎皮質(zhì)、髓質(zhì)可見大量結(jié)晶，有游離結(jié)石形成，腎乳頭可見鈣化斑，腎盂明顯擴(kuò)張積水。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 外觀特征 空白對(duì)照組大鼠反應(yīng)靈敏，毛色有光澤，飲水適量，食欲旺盛，體質(zhì)量由快變慢逐步增加，大便呈顆粒狀，尿量正常，尿色淡黃。各組1%乙二醇飲水，2%氯化銨1 mL/100 g灌胃造模大鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍，精神萎靡，毛發(fā)無光澤，掉毛現(xiàn)象嚴(yán)重，飲水量大，食欲下降，活動(dòng)少，尿量開始正常，后期尿量增加較大，大便稀溏。治療組則出現(xiàn)尿量增加較少，精神飲食活動(dòng)基本正常，其中混合提取組、水提醇沉組中大鼠的精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、飲食及排尿量均優(yōu)于水提組，與五淋化石丸組相當(dāng)。

3.2 大鼠水負(fù)荷試驗(yàn)

表1 復(fù)方廣金錢草不同工藝提取物對(duì)大鼠利尿作用的影響（x±s，n=10）Tab.1 Diurctic action of Compound Glechoma Graneles extractives processed by different methods in rats（x±s，n=10）

與對(duì)照組比較，水提醇沉組、混合提取組及氫氯噻嗪組均能顯著增加大鼠尿量，提示復(fù)方廣金錢草水提醇沉組和混合提取組具有一定的利尿作用。見表1。

3.3 大鼠排石實(shí)驗(yàn)

3.3.1 尿液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果及分析

由表2可知，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠尿量極顯著升高 （P＜0.01）、尿草酸量極顯著升高 （P＜0.01）、尿鈣量極顯著降低 （P＜0.01）。與模型組相比，五淋化石丸組尿草酸顯著降低（P＜0.05），尿鈣極顯著增加 （P＜0.01）。藥物組與模型組相比，水提醇沉組和混合提取組尿量顯著降低 （P＜0.01），水提組、水提醇沉組、混合提取組尿草酸極顯著性降低 （P＜0.01），水提組尿鈣量極顯著升高 （P＜0.01），混合提取組尿鈣量顯著升高 （P＜0.05）。各組之間pH值無顯著性差異。

表2 高草酸誘致草酸鈣結(jié)石模型中大鼠尿生化檢驗(yàn)結(jié)果 （x±s，n=10）Tab.2 Urinary biochem istry results of rats in each group in experimen tal hyperoxaluria（x±s，n=10）

3.3.2 腎草酸、腎鈣檢測(cè)指標(biāo)結(jié)果及分析

由表3可知，與空白對(duì)照組相比，模型組大鼠腎草酸濃度、腎鈣濃度極顯著升高 （P＜0.01）。與模型組相比，五淋化石丸組腎草酸濃度極顯著降低（P＜0.01），腎鈣濃度顯著降低 （P＜0.05）。藥物組與模型組相比，水提組、水提醇沉組和混合提取組草酸濃度極顯著降低 （P＜0.01），水提組、混合提取組腎鈣濃度極顯著性降低 （P＜0.01）。

表3 高草酸誘致草酸鈣結(jié)石模型中大鼠腎勻漿生化檢驗(yàn)結(jié)果 （x±s）Tab.3 Biochem istry results in kidney homogenate of rats in each group in experimental hyperoxaluria（x±s）

3.3.3 腎臟病理切片評(píng)價(jià) 如圖1所示，A、B、C、D、E、F 6組Wister雄性大鼠腎臟病理切片圖，除A圖 （正常對(duì)照組）外，B、C、D、E、F圖中均可以觀察到暗紫色透明為主草酸鈣結(jié)晶存在，腎小管管腔擴(kuò)大，其中B圖 （乙二醇誘石，模型組）中大塊草酸鈣結(jié)晶聚集。C（乙二醇誘石+五淋化石丸干預(yù)組）、D、E、F圖 （乙二醇誘石+復(fù)方廣金錢草提取物干預(yù)組）存在草酸鈣的數(shù)量、形狀及大小與B圖 （模型組）比較，均有不同程度降低。而在A圖 （空白對(duì)照組）中沒有觀察到明顯的草酸鈣結(jié)晶。這表明了乙二醇誘致Wister雄性大鼠腎損傷的草酸鈣結(jié)石模型成功。由于鈣化斑是長(zhǎng)期腎臟結(jié)石導(dǎo)致的病理現(xiàn)象，所以以上各組均為出現(xiàn)鈣化斑。

由表4可知，模型對(duì)照組與空白組比較有極顯著性差異，說明該試驗(yàn)造模條件合適；五淋化石丸組和各藥物組與模型組相比均有極顯著性差異。結(jié)果表明，不同工藝得到的復(fù)方廣金錢草提取物均能明顯防止乙二醇、氯化銨誘發(fā)的腎結(jié)石形成，并使大鼠結(jié)石形成率降低。水提組和混合提取組之間在腎結(jié)石程度方面存在顯著性差異 （P＜0.05），其余各提取工藝之間無顯著性差異。

圖1 各組大鼠腎組織切片CaOx結(jié)晶顯微鏡檢查 （HE染色，放大100倍）Fig.1 Crystalline formations in the rat kidney（HE staining.，m agnification×100）

表4 復(fù)方廣金錢草不同工藝提取物對(duì)大鼠腎結(jié)石的影響（x±s）Tab.4 Lithagogue action for kidney stone of Compound G lechoma Granules extractives processed by differentmethods in rats（x±s）

4 討論

1%乙二醇飲水，2%氯化銨1 mL/100 g灌胃，30 d，大鼠在飼養(yǎng)前期狀況良好，隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，狀況逐漸變差；腎剖面顯示有少量散在草酸鈣結(jié)晶，無炎性細(xì)胞，腎皮質(zhì)和髓質(zhì)無充血，腎小管略有擴(kuò)張。而1%乙二醇飲水，0.5μg 1α-羥基維生素D3隔天灌胃14 d，大鼠造模過程中出現(xiàn)大鼠死亡，體重急劇下降，掉毛現(xiàn)象嚴(yán)重，飲水較多，吃飼料較少；腎剖面有大量游離結(jié)石；有炎性細(xì)胞，腎皮質(zhì)和髓質(zhì)充血，腎小管擴(kuò)張明顯。1α-羥基維生素D3會(huì)促進(jìn)鈣離子的吸收，加速草酸鈣結(jié)晶的形成，從而容易形成結(jié)石，結(jié)石狀況嚴(yán)重，嚴(yán)重?fù)p壞了大鼠的腎臟，大鼠的狀況、存活時(shí)間短。結(jié)石的形成是緩慢的，中藥治療結(jié)石是個(gè)長(zhǎng)期的過程，且藥效較溫和，復(fù)方廣金錢草為臨床經(jīng)驗(yàn)方，主要用于腎結(jié)石碎石后輔助排石以及后期服用防止復(fù)發(fā)的作用，因此在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃Y選時(shí)選擇了造模成功率較大，造模強(qiáng)度較弱的造模條件 （1%乙二醇飲水，2%氯化銨1 mL/100 g灌胃［18］），而舍棄了造模強(qiáng)度過大的造模條件 （1%乙二醇飲水，0.5μg 1α-羥基維生素D3隔天灌胃［19］）。

綜合試驗(yàn)?zāi)蛞汉湍I的生化指標(biāo)結(jié)果和腎臟的病理切片結(jié)果分析，得出該復(fù)方可能具有抑制體內(nèi)草酸形成及促進(jìn)鈣離子排泄的作用，從而達(dá)到排石和防止結(jié)石復(fù)發(fā)的作用。在相當(dāng)于人一天給藥劑量的情況下，各組大鼠尿草酸均有不同程度減少，尿鈣均有不同程度增加，其中水提組尿草酸的減少，尿鈣的增加最明顯，這可能與水提組大鼠的體重增長(zhǎng)較少、給藥期間的飲水量較少有關(guān)；水提醇沉組和混合提取組的藥效較水提組好，可能是藥物經(jīng)過醇沉等處理后除去了部分雜質(zhì)，減輕了大鼠的吸收負(fù)擔(dān)，促進(jìn)了有效成分的吸收，達(dá)到了增效的作用。

為將復(fù)方廣金錢草由臨床經(jīng)驗(yàn)方開發(fā)成質(zhì)量穩(wěn)定、療效好的六類新藥復(fù)方廣金錢草顆粒，本實(shí)驗(yàn)觀察了復(fù)方廣金錢草的不同提取工藝的排石利尿結(jié)果，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同工藝得到的復(fù)方廣金錢草提取物對(duì)腎結(jié)石的形成都具有良好的抑制作用，說明傳統(tǒng)的復(fù)方廣金錢草湯劑經(jīng)過工藝學(xué)優(yōu)化得到的提取物，既能達(dá)到服用體積小、醫(yī)從性好、攜帶方便等效果，又保證其藥效不降低。

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The impact of extraction technique for Com pound Glechoma Granules on removing kidney stone in rats

ZHANG Hui1， CHEN Zhuo-han1， LU Hai-ling1， LIU Tian-zhu1， GUO Li-bing1*， LIXing-shan2，CHEN Yan-Fen1
（1.College of Traditionnal Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006.China；2.The Fifth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510700，China）

Compound Glechoma（CG）Granules；water load test；removal of kidney stone；rats

R284.2

：A

：1001-1528（2015）06-1186-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.007

2014-08-12

廣東省科技廳社會(huì)發(fā)展科技項(xiàng)目 （20120318063），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （81073045，81302894）

張 慧（1990—），女，碩士生，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)成分研究與開發(fā)。E-mail：zhanghuiapple@sina.com

*通信作者：郭麗冰 （1965—），女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥化學(xué)成分研究與開發(fā)。