三種口腔潰瘍中藥制劑對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和膠原合成的影響

金姍姍， 鄭雅文， 張 潔， 齊 銳， 劉 斌， 李志革

（蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

三種口腔潰瘍中藥制劑對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)增殖和膠原合成的影響

金姍姍， 鄭雅文， 張 潔， 齊 銳， 劉 斌， 李志革*

（蘭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000）

目的探討3種治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍中藥制劑 （西瓜霜、云南白藥、甘草瀉心湯）在細(xì)胞水平上促進(jìn)潰瘍愈合的作用機(jī)制。方法建立小鼠口腔成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，以華素片為對(duì)照，采用MTT、Elisa測(cè)定3種中藥制劑對(duì)成纖維細(xì)胞增殖、膠原合成的影響。結(jié)果西瓜霜在促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及膠原合成，抑制MMP-2，促進(jìn)TIMP-1方面有較顯著的作用。云南白藥促進(jìn)能夠HYP的分泌和抑制MMP-2的分泌。甘草瀉心湯對(duì)成纖維細(xì)胞有一定的抑制作用。結(jié)論提示臨床上治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍時(shí)應(yīng)聯(lián)合用藥或分期用藥。

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍；西瓜霜；云南白藥；甘草瀉心湯；小鼠成纖維細(xì)胞L929；膠原合成；羥脯氨酸 （HYP）；金屬基質(zhì)蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍（recurrent oral ulcer）是常見(jiàn)的口腔疾病之一，發(fā)病率高達(dá)20%左右，為口腔黏膜發(fā)病首位［1］。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍具有周期性、復(fù)發(fā)性和自限性等特征，潰瘍燒灼痛明顯，常給患者的生活和工作帶來(lái)不便［2］。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍誘因復(fù)雜、機(jī)制不明，在臨床治療中以緩解疼痛、促進(jìn)愈合為主，并無(wú)明確有效的治療方法。市面上治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的藥物眾多，但藥物作用機(jī)制的研究比較欠缺，這造成醫(yī)生和患者在選擇藥物時(shí)具有盲目性和偶然性。成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍愈合的重要過(guò)程［3］。成纖維細(xì)胞分泌的金屬基質(zhì)蛋白酶 （MMP）及其抑制劑（TIMP），共同參與和調(diào)控胞外基質(zhì)的降解和重建［4］。

中草藥制劑現(xiàn)已成為治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的常用藥物，主要以市售西瓜霜、云南白藥等為主［5］。目前本課題組在前期甘草瀉心湯研究與應(yīng)用的基礎(chǔ)上，提出了甘草瀉心湯治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的觀點(diǎn)，并取得了一定的臨床效果，但是這類(lèi)藥物的治療機(jī)理，尤其是在潰瘍愈合方面的研究，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了體外小鼠口腔成纖維細(xì)胞L929培養(yǎng)模型，以西藥制劑華素片為對(duì)照，研究中藥制劑西瓜霜、云南白藥、甘草瀉心湯對(duì)小鼠口腔成纖維細(xì)胞增殖及對(duì)羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）金屬基質(zhì)蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）金屬基質(zhì)蛋白酶抑制因子-1（metal matrix protease inhibitor-1，TIMP-1）合成的影響，在細(xì)胞水平上揭示其在潰瘍愈合過(guò)程中的作用及機(jī)制，從而為臨床用藥提供一定的實(shí)驗(yàn)和選擇依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 小鼠口腔成纖維細(xì)胞系L929，購(gòu)自中科院上海生化細(xì)胞所。

1.2 藥品及試劑 西瓜霜 （主要成分為西瓜霜、鍛硼砂、山豆根等），購(gòu)自桂林三金藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)130214；云南白藥 （主要成分為三七、重樓、麝香），購(gòu)自云南白藥集團(tuán)股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào) ZDA1311；華素片 （主要成分碘），購(gòu)自北京華素制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)1303142；甘草瀉心湯（甘草12 g，黃芩9 g，半夏12 g，大棗12枚，黃連3 g，干姜9 g，黨參9 g。購(gòu)自惠仁堂藥店），自制。DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清，購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；胰蛋白酶、四唑鹽（MTT）、二甲基亞砜（DMSO），購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；HYP、MMP-2、TIMP-1測(cè)定試劑盒，購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 試驗(yàn)藥液制備 將甘草瀉心湯草藥粉碎成極細(xì)粉過(guò)篩并混合均勻，置于200 mL超純水中，4℃24 h，12 000 r/min離心30 min，取上清液冷凍干燥，制得甘草瀉心湯水提物。分別稱(chēng)取5 mg的西瓜霜、云南白藥、華素片、甘草瀉心湯溶于含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 IU/mL的10 mL DMEM培養(yǎng)基，用磁力攪拌器攪拌24 h后用氯氣滅菌，再倍比稀釋為125、62.5、31.25μg/mL的藥液備用。0.00μg/mL為陰性對(duì)照組。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)［6］小鼠口腔成纖維細(xì)胞系L929用含10%胎牛血清和青、鏈霉素各100 IU/m L的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2飽和濕度的恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)2～3 d左右，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)傳代。將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液棄去，加0.25%胰酶消化2～3 min，倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)大多數(shù)細(xì)胞由長(zhǎng)梭形變圓時(shí)，立即向培養(yǎng)瓶中加培養(yǎng)液約5 mL，并輕輕吹打瓶壁使細(xì)胞脫落，按1∶4比例傳代培養(yǎng)于75 mL培養(yǎng)瓶。

2.3 細(xì)胞接種［6］取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 L929細(xì)胞，用0.25%胰酶充分消化成單細(xì)胞懸液。用含10%血清的DMEM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104個(gè)/mL，接種到96孔板，每孔接種100μL，每孔設(shè)置6個(gè)重復(fù)孔。細(xì)胞貼壁24 h后，棄上清液，分別加入制備好的不同藥液100μL，繼續(xù)培養(yǎng)。陰性對(duì)照組為移去上清后，加入100μL含10%血清的DMEM培養(yǎng)基。

2.4 MTT檢測(cè)［7］當(dāng)細(xì)胞與藥液作用24 h、48 h、72 h后，收集上清液，加入不含血清的DEME培養(yǎng)基100μL，再每孔加入MTT（5 g/L）20μL。常規(guī)繼續(xù)孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO（二甲基亞砜）150μL，在振蕩器上振蕩10 min，待紫色結(jié)晶完全溶解后，立即用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀測(cè)定490 nm處的吸光度值 （OD值）。

2.5 HYP、MMP-2、TIMP-1測(cè)定 收集上清液，上清液中的HYP、MMP-2、TIMP-1水平分別采用小鼠HYP、MMP-2、TIMP-1 Elisa試劑盒進(jìn)行測(cè)定。按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上清液中HYP、MMP-2、TIMP-1的水平。每一個(gè)樣品重復(fù)3次。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，各項(xiàng)指標(biāo)水平以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。

3 結(jié)果

3.1 3種中藥制劑對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖的影響 24 h時(shí)，西瓜霜 （圖1-A）各質(zhì)量濃度組OD值波動(dòng)較大，可能由于藥物的加入，成纖維細(xì)胞需要一定的適應(yīng)時(shí)間；云南白藥 （圖1-B）各質(zhì)量濃度組OD值與對(duì)照組差距無(wú)明顯意義。甘草瀉心湯 （圖1-C）與西瓜霜組變化相似。華素片 （圖1-D）各質(zhì)量濃度組OD值與對(duì)照組差距無(wú)明顯意義。48 h時(shí)，西瓜霜、華素片在31.25μg/mL下可以以時(shí)間-質(zhì)量濃度依賴(lài)性地促進(jìn)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)；甘草瀉心湯隨質(zhì)量濃度增加OD值降低，抑制作用明顯。云南白藥各質(zhì)量濃度組OD值與對(duì)照組差距無(wú)明顯意義。72 h時(shí)，西瓜霜、云南白藥、甘草瀉心湯、華素片在125μg/mL下培養(yǎng)72 h時(shí)對(duì)成纖維細(xì)胞有一定的抑制作用。見(jiàn)圖1。

圖1 不同藥物組對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929增殖的影響Fig.1 Effect of different herbal preparations on the p roliferation of m ice fib roblasts L929

3.2 3種中藥制劑48 h時(shí)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞HYP水平的影響 結(jié)果如圖2所示，西瓜霜組、云南白藥組在31.25μg/m L時(shí)小鼠成纖維細(xì)胞的HYP水平顯著高于陰性對(duì)照組，隨藥物質(zhì)量濃度增加，促進(jìn)作用下降，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。甘草瀉心湯組隨藥物質(zhì)量濃度增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)，在125μg/mL時(shí)達(dá)到頂峰。華素片組在31.25μg/m L、125μg/m L時(shí)小鼠成纖維細(xì)胞的HYP水平顯著升高 （P＜0.05）。在該項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)中，西瓜霜、云南白藥、華素片均在較低質(zhì)量濃度就出現(xiàn)一定的促進(jìn)作用。

3.3 3種中藥制劑48 h時(shí)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞MMP-2水平的影響 結(jié)果如圖3所示，4組藥物在31.25μg/mL水平下對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的MMP-2水平有抑制作用，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在62.25 μg/mL水平下對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的MMP-2水平具有顯著性抑制作用；當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到125μg/m L云南白藥、甘草瀉心湯、華素片組小鼠成纖維細(xì)胞的MMP-2值顯著仍低于陰性對(duì)照組。在該項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)中，華素片隨質(zhì)量濃度的增加抑制作用加強(qiáng)。

圖2 3種中藥制劑48 h時(shí)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞HYP水平的影響Fig.2 Effects of three herbal preparations on hydroxyproline level in m ice fibrob last in 48 h

3.4 3種中藥制劑48 h時(shí)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞TIMP-1水平的影響 結(jié)果圖4所示，西瓜霜、甘草瀉心湯對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的TIMP-1有明顯促進(jìn)作用；而在62.25μg/mL下云南白藥和華素片具有抑制作用。

4 討論

圖3 3種中藥制劑48 h時(shí)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞MMP-2水平的影響Fig.3 E ffects of three herbal preparations on MMP-2 level in m ice fibroblast in 48 h

圖4 3種中藥制劑48 h時(shí)對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞TIMP-1水平的影響Fig.4 Effects of three herbal preparations on TIMP-1 level in m ice fibroblast in 48 h

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍是以疼痛和周期性復(fù)發(fā)為特點(diǎn)的口腔黏膜自限性潰瘍性損害，是口腔黏膜最常見(jiàn)的疾病之一。復(fù)發(fā)性口腔潰瘍誘因復(fù)雜、機(jī)制不清，目前臨床上治療的目的主要是緩解疼痛、促進(jìn)愈合，而藥物治療機(jī)制的研究比較少見(jiàn)報(bào)道。傳統(tǒng)中藥制劑在臨床上有廣泛應(yīng)用并取得了一定的治療效果，但其作用機(jī)制的研究較匱乏。本試驗(yàn)建立小鼠口腔成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)模型，以西藥制劑華素片為對(duì)照，從細(xì)胞水平研究西瓜霜、云南白藥、甘草瀉心湯對(duì)成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成的影響，揭示中藥制劑在潰瘍愈合過(guò)程中的作用機(jī)制。

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍愈合的過(guò)程包括舊膠原的降解和新膠原的重排、沉積，參與此過(guò)程的主要細(xì)胞是成纖維細(xì)胞，其主要作用是參與形成肉芽組織、合成并分泌胞外基質(zhì)、金屬基質(zhì)蛋白酶 （MMPs）及其抑制因子（TIMPs）［8］。在IL-1、IL-4、PDGF、FGF、及TNF等刺激下，由間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái)的成纖維細(xì)胞合成和分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原。同時(shí)成纖維細(xì)胞合成和分泌MMPs及其TIMPs共同參與和調(diào)控了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，MMPs和TIMPs的相互作用及平衡是胞外基質(zhì)重建的關(guān)鍵［9］。本實(shí)驗(yàn)中西瓜霜和華素片可促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖，提示其促進(jìn)潰瘍愈合的作用可能與促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖有關(guān)，而云南白藥對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)顯著作用，甘草瀉心湯對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖具有抑制作用。

羥脯氨酸 （HYP）是膠原蛋白的主要組成成分，具有多種生理功能及獨(dú)特的生物活性，常作為各種軟組織疾病的藥物，如結(jié)締組織受損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等，同時(shí)具有加快傷口愈合的作用，可用于治療各種皮膚疾?。?0-11］。李秋營(yíng)等通過(guò)對(duì)成纖維細(xì)胞中HYP水平的測(cè)定，較好地反映了成纖維細(xì)胞活性、增殖及膠原合成等情況［12］。與對(duì)照組相比，在4種藥物作用下，上清液中的HYP水平明顯上升，說(shuō)明4種藥物均可促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞分泌HYP，從而提示4種藥物在潰瘍愈合過(guò)程中可促進(jìn)膠原的合成。

基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一組具有極大同源性的蛋白內(nèi)肽酶的總稱(chēng)，與胞外基質(zhì)降解和結(jié)締組織修復(fù)緊密相關(guān)［13］。基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）是MMPs的特異性抑制因子，以1∶1的比例與MMPs結(jié)合，抑制其活性［14］。MMPs與TIMPs的平衡的破壞會(huì)影響到正常組織的重塑和創(chuàng)傷的愈合，其與許多疾病的發(fā)生相關(guān)［15］。MMP-2、9在正常的口腔黏膜組織中呈弱陽(yáng)性表達(dá)，在慢性潰瘍面中MMP-2、9表達(dá)與對(duì)照組有顯著差異，呈陽(yáng)性表達(dá)，同時(shí)在慢性潰瘍面還存在TIMP-1的減少［16-17］?？垫骆碌难芯勘砻髟诓±?xiàng)l件下，MMP-2能降解黏膜組織中的Ⅳ膠原，表明其在人體黏膜組織的溶解破壞過(guò)程中有重要作用［18］。因此，可以推測(cè)口腔潰瘍過(guò)程中胞外基質(zhì)及基底膜的破壞與MMP-2的表達(dá)水平有關(guān)。在潰瘍愈合初期，抑制成纖維細(xì)胞MMP-2的表達(dá)、促進(jìn)TIMP-1的表達(dá)有利于潰瘍的愈合。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，4種藥物都具有抑制成纖維細(xì)胞合成分泌MMP-2的作用，西瓜霜和甘草瀉心湯可促進(jìn)TIMP-1的合成分泌，但云南白藥和華素片則對(duì)TIMP-1的合成分泌具有抑制作用。提示西瓜霜和甘草瀉心湯在潰瘍愈合的初期可抑制成纖維細(xì)胞MMP-2的表達(dá)和促進(jìn)TIMP-1的表達(dá)，從而有利于潰瘍愈合初期的膠原合成與沉積。

綜上所述，西瓜霜在促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖及膠原合成，抑制MMP-2，促進(jìn)TIMP-1方面有較顯著的作用。云南白藥對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)促進(jìn)作用，但可促進(jìn)HYP的分泌和抑制MMP-2的分泌，在潰瘍愈合的早期發(fā)揮重要的作用。甘草瀉心湯對(duì)成纖維細(xì)胞有一定的抑制作用，但可通過(guò)促進(jìn)HYP、TIMP-1分泌，抑制MMP-2分泌，來(lái)促進(jìn)潰瘍的愈合。3種治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的中藥制劑對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞增殖和膠原合成的作用機(jī)制不同，提示臨床上治療復(fù)發(fā)性口腔潰瘍時(shí)應(yīng)聯(lián)合用藥或分期用藥，從而獲得更好的臨床治療效果，但要明確藥物對(duì)潰瘍愈合的具體作用機(jī)制，還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)探究。

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Effects of three herbal preparations for recurrent oral ulcer on proliferation and collagen synthesis of the fibroblasts in m ice

JIN Shan-shan， ZHENG Ya-wen， ZHANG Jie， QIRui， LIU Bin， LIZhi-ge*
（School of Stomatology，Lanzhou University，Lanzhou 730000，China）

AIMTo study themechanisms of three kinds of herbal preparations（Watermelon Frost，Yunnan Baiyao，Gancao Xiexin Decoction）for recurrent oral ulcer on ulcer healing in cellular levels.METHODSMice fibroblast L929 was used as the in vitro model for recurrent oral ulcer；cydiodin was employed as the control drug. The effects of herbal preparations on the fibroblast proliferation and collagen production were determined by MTT assay and Elisa Kit，respectively.RESULTSWatermelon Frost promoted the fibroblast proliferation and collagen synthesis，inhibited MMP-2 level and increased TIMP-1 level；Yunnan Baiyao stimulated the secretion of HYP and down-regulated the secretion ofMMP-2 level；Gancao Xiexin Decoction inhibited the fibroblast.CONCLUSIONThe experimental data suggests that the clinical treatment for recurrent oral ulcer should be approached by combining these three preparations or applying them in different stages.

recurrent oral ulcer；Watermelon Frost；Yunnan Baiyao；Gancao Xiexin Decoction；mice fibroblast；collagen synthesis；hydroxyproline（HYP）；metalmatrix protease inhibitor-1（TIMP-1）

R285.5

：A

：1001-1528（2015）06-1176-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.06.005

2014-07-15

“本科教學(xué)工程”國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃 （201310730167）；甘肅省中醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題 （GZK-2011-9）；甘肅省自然科學(xué)基金（1208RJYA011）

金姍姍（1992—），女，本科生。Tel：15214011979，E-mail：jinss1022@163.com

*通信作者：李志革 （1968—），男，教授，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)榭谇活M面外科學(xué)。Tel：13993141029，E-mail：lizhg@lzu.edu.cn