狗牙根黑粉菌冬孢子萌發(fā)影響因素及產(chǎn)孢培養(yǎng)基篩選

羅海瀾+王飛+馬旭園+張群之+羅海淑+劉少娟

摘要：研究不同溫度、水分含量、光照條件、pH值對(duì)狗牙根黑粉菌冬孢子萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，溫度23～28℃、光照與黑暗間隔12h、pH值5～7的條件最適合冬孢子萌發(fā)；同時(shí)，還觀察和描述了狗牙根黑粉菌冬孢子的形態(tài)特征和萌發(fā)過(guò)程；此外，還研究了不同培養(yǎng)基對(duì)次生小孢子形態(tài)及產(chǎn)孢數(shù)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)9種培養(yǎng)基均能產(chǎn)孢，在4%葡萄糖酵母膏液體培養(yǎng)基中產(chǎn)孢量最多，存在3種不同形態(tài)的次生孢子，帶莢膜的次生孢子無(wú)活性。

關(guān)鍵詞：狗牙根黑粉菌；冬孢子；萌發(fā)率；產(chǎn)孢培養(yǎng)基；次生孢子

中圖分類號(hào)：S432.4+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0166-03

狗牙根[Cynodondactylon（L.）Pers.]因其根莖繁殖能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快、耐踐踏、抗旱性強(qiáng)，成為鋪設(shè)運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、停機(jī)坪、高爾夫果嶺、公園、庭院綠化的主要草坪草種[1-2]。但近年來(lái)，狗牙根黑穗病在我國(guó)發(fā)生普遍且態(tài)勢(shì)嚴(yán)重，嚴(yán)重影響我國(guó)草坪質(zhì)量及其他場(chǎng)地綠化效果。狗牙根黑穗病是由擔(dān)子菌亞門黑粉菌目黑粉菌屬狗牙根黑粉菌引起的一種的真菌性病害。狗牙根黑穗病是系統(tǒng)侵染，引發(fā)全株性病害。最為直觀明顯的癥狀即開(kāi)花期穗產(chǎn)生充滿孢子堆的病癭，表現(xiàn)為一種典型的苗期侵染、花期發(fā)病的癥狀。感病植物不能正常開(kāi)花結(jié)子，導(dǎo)致植株不育，一般7—9月為黑穗病發(fā)病高峰期[3]。狗牙根黑粉菌主要靠冬孢子傳播，匍匐莖也能傳播。Garcia-Guzman等發(fā)現(xiàn)，黑粉菌通過(guò)來(lái)自種皮或土壤的越冬孢子菌絲侵染發(fā)芽種子的胚芽鞘，并擴(kuò)散至整個(gè)植物組織，黑粉菌對(duì)狗牙根的種子萌發(fā)、出苗無(wú)影響，但被其侵染的狗芽根匍匐枝的生長(zhǎng)、干物質(zhì)總量、競(jìng)爭(zhēng)力都明顯降低了[4]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)狗牙根黑穗病的關(guān)注不多，狗牙根黑粉菌的致病機(jī)理尚不清楚。因此，本研究對(duì)狗牙根黑粉菌冬孢子的萌發(fā)條件、萌發(fā)過(guò)程及黑粉菌產(chǎn)次生孢子培養(yǎng)基進(jìn)行探索，為進(jìn)一步研究狗牙根黑粉菌的致病機(jī)制及該病原菌與狗牙根之間的互作提供參考。

1材料與方法

1.1材料

狗牙根黑穗病標(biāo)樣采自漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校的校園草坪，室內(nèi)自然風(fēng)干后于室內(nèi)紙袋保存。試驗(yàn)用冬孢子取自發(fā)病穗，黑粉菌菌株LHL1由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定，保存于中國(guó)武漢菌株保藏中心。

1.2冬孢子的分離

選取未抽穗的病穗，在超凈工作臺(tái)中用75%乙醇消毒5s，再用0.1%氯化汞消毒4min，然后用無(wú)菌水漂洗5次。用無(wú)菌鑷子將穗外膜撕開(kāi)，再輕刮下病穗上的黑粉菌冬孢子于無(wú)菌水中制成冬孢子懸浮液備用，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)，冬孢子的濃度為10萬(wàn)個(gè)/mL。

1.3不同因素對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

1.3.1光照對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

取100μL冬孢子懸浮液并用三角玻璃棒均勻涂布于PSA（馬鈴薯蔗糖固體培養(yǎng)）平板上，將PSA平板放在溫度為28℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，且分別置于連續(xù)光照（日光燈，光強(qiáng)1400lx）、12h/12h光暗交替、黑暗條件下培養(yǎng)，于16h后顯微鏡下觀察、統(tǒng)計(jì)并比較這3種條件下冬孢子的萌發(fā)率。

1.3.2水分對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

室溫下將冬孢子分別浸于無(wú)菌水中0、12、24、36、72h，吸取冬孢子懸浮液100μL均勻涂布于PSA平板上，該平板放在28℃、光照（日光燈，光強(qiáng)1400lx）條件下的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，分別于16h后顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)不同浸水時(shí)間下的冬孢子萌發(fā)率。

1.3.3溫度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

取100μL冬孢子懸浮液并用三角玻璃棒均勻涂布于PSA平板上，將PSA平板放在光照（日光燈，光強(qiáng)1400lx）條件下的培養(yǎng)箱中，分別在15、18、23、28、33、38℃等6個(gè)溫度條件下培養(yǎng)，16h后顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)不同溫度下的冬孢子萌發(fā)率。

1.3.4pH值對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

用2mol/LHCl和2mol/LNaOH調(diào)節(jié)PSA培養(yǎng)基的初始pH值為4、5、6、7、8、9、10，取100μL冬孢子懸浮液均勻涂布于PSA平板上，將PSA平板放在28℃、光照（日光燈，光強(qiáng)1400lx）條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，16h后顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)不同初始pH值的PSA培養(yǎng)基平板上冬孢子的萌發(fā)率。

1.4狗牙根黑粉菌冬孢子萌發(fā)及形態(tài)觀察

用改良玻片培養(yǎng)法觀察冬孢子的萌發(fā)情況，具體做法如下：先將制備好的無(wú)菌冬孢子懸浮液與融化的無(wú)菌低熔點(diǎn)瓊脂糖混合，用毛細(xì)滴管吸取孢子與瓊脂糖混合液滴在無(wú)菌載玻片上，迅速蓋上蓋玻片并輕壓使滴液分散成薄層，置于鋪有濾紙的無(wú)菌培養(yǎng)皿中；再滴加數(shù)滴無(wú)菌水，蓋上培養(yǎng)皿蓋，整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌超凈臺(tái)上完成。培養(yǎng)皿放置于23℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6、24h后取出，經(jīng)苯胺藍(lán)染色20min，用脫色液脫色2h后于顯微鏡下觀察冬孢子的萌發(fā)形態(tài)。

1.5狗牙根黑粉菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)

利用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基、燕麥液體培養(yǎng)基、麩皮液體培養(yǎng)基、玉米粉液體培養(yǎng)基、完全液體培養(yǎng)基、4%葡萄糖酵母膏液體培養(yǎng)、2%甘油酵母膏液體培養(yǎng)基、狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)基9種液體培養(yǎng)基分別對(duì)狗牙根黑粉菌產(chǎn)孢效果和孢子形態(tài)進(jìn)行試驗(yàn)。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[5]；燕麥液體培養(yǎng)基、麩皮液體培養(yǎng)基、玉米粉液體培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[6]；完全液體培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[7]；4%葡萄糖酵母膏液體培養(yǎng)基、2%甘油酵母膏液體培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)[8]；狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)基配方：50g狗牙根干草在鍋里煮沸后繼續(xù)煮0.5h，然后用紗布過(guò)濾得液體，添加10g酵母膏，用自來(lái)水加到1000mL。

將保存于4℃營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上的LHL1菌株接種于PSA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)進(jìn)行活化。無(wú)菌條件下用接種針從培養(yǎng)好的平皿中挑取一單菌落接種于裝有100mLPS液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在恒溫28℃、轉(zhuǎn)速200r/min的搖床中培養(yǎng)3d，成為種子液培養(yǎng)。按0.6%接種量吸取種子液轉(zhuǎn)接于含50mL液體培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，在轉(zhuǎn)速為200r/min的條件下?lián)u床振蕩培養(yǎng)，搖菌4d后，用膠頭滴管吸1滴菌液于載破片上，苯胺藍(lán)染色后，顯微鏡下觀察次生孢子形態(tài)；菌液稀釋100倍用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)次生孢子的數(shù)量。

2結(jié)果與分析

2.1不同因素對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

2.1.1光照條件對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，光照、黑暗條件下，狗牙根黑粉菌冬孢子都能萌發(fā)，且光照能促進(jìn)冬孢子萌發(fā)。持續(xù)光照培養(yǎng)的冬孢子萌發(fā)率為31%，光照與黑暗間隔12h培養(yǎng)的萌發(fā)率為40%，持續(xù)黑暗培養(yǎng)萌發(fā)率為27%左右，說(shuō)明在自然光周期條件下萌發(fā)較好，這與玉米瘤黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)光的需求[9]一致。

2.1.2水分條件對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，冬孢子浸泡0～72h都能萌發(fā)，且浸泡48h的孢子萌發(fā)率最高；在0～48h范圍內(nèi)隨著浸水時(shí)間延長(zhǎng)，冬孢子的萌發(fā)率有所提高。與水稻黑粉菌冬孢子要浸泡24h才能萌發(fā)相比，狗牙根黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)水分的需求更低，這可能與在干燥器內(nèi)保存比在室內(nèi)紙袋中保存冬孢子散失的水分更多有關(guān)[7]。然而，一直浸泡在無(wú)菌水中的冬孢子萌發(fā)率有所降低，這可能與水中氧氣含量低，不能滿足冬孢子萌發(fā)對(duì)氧氣的需求有關(guān)。這與玉米瘤黑粉菌及水稻黑粉菌冬孢子試驗(yàn)的結(jié)果[7，9]相似。

2.1.3溫度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

圖1顯示，在15～38℃范圍內(nèi)，冬孢子都能萌發(fā)。在18～33℃下，冬孢子都能較好地萌發(fā)，其中23℃左右最適合冬孢子萌發(fā)，此時(shí)在PSA平板上培養(yǎng)16h的孢子萌發(fā)率高達(dá)53%，培養(yǎng)36h時(shí)萌發(fā)的孢子已長(zhǎng)成大菌落，無(wú)法再統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，此時(shí)肉眼可見(jiàn)白色菌落，說(shuō)明狗牙根冬孢子萌發(fā)非?？?。

2.1.4pH值對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響圖2顯示，在pH值為4～10的范圍內(nèi)，冬孢子均可以萌發(fā)；在pH值為5～7時(shí)，冬孢子萌發(fā)率較高?？梢?jiàn)偏堿性環(huán)境不利于冬孢子萌發(fā)。

2.2狗牙根黑粉菌冬孢子形態(tài)及萌發(fā)過(guò)程

圖3顯示，狗牙根黑粉菌冬孢子淡褐色或棕色，近球形或卵形，直徑為7～9μm，膜面光滑而薄，這與程建斌的描述[3]相符。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，冬孢子培養(yǎng)6h后開(kāi)始萌發(fā)，24h后呈樹(shù)枝狀；冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生先菌絲，一端萌發(fā)或兩端同時(shí)萌發(fā)，先菌絲上側(cè)生擔(dān)孢子；先菌絲有隔，偶見(jiàn)長(zhǎng)先菌絲，長(zhǎng)先菌絲上不產(chǎn)生擔(dān)孢子，短先菌絲上擔(dān)孢子多形成樹(shù)枝狀。

2.3LHL1菌株的形態(tài)特征

冬孢子在PSA平板上萌發(fā)后形成雪花樣白色菌落，從菌落中挑取單菌落進(jìn)行分離培養(yǎng)得到菌株LHL1。菌株LHL1在PSA平板上28℃光照培養(yǎng)2周后，菌落直徑達(dá)到1.4cm左右，近圓形，邊緣整齊，正面乳白色，質(zhì)地近緊密為一薄層，背面黃褐色（圖4-A）。顯微鏡下LHL1菌為長(zhǎng)條形，一端膨大，一端細(xì)長(zhǎng)，分裂生長(zhǎng)（圖4-B）。

2.4不同液體培養(yǎng)基對(duì)LHL1生物量及產(chǎn)孢的影響

如圖5所示，9種液體培養(yǎng)基以馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基生物量最大，其他從大到小依次為4%葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基、2%甘油酵母膏液體培養(yǎng)基、完全液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基、玉米粉液體培養(yǎng)基、燕麥液體培養(yǎng)基、狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)、麩皮液體培養(yǎng)基。圖5還顯示，9種液體培養(yǎng)基均能夠產(chǎn)生次生孢子，但不同培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量和孢子形態(tài)不同，其中馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大，玉米粉液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最小。在燕麥、玉米粉、麩皮、完全及甘油酵母膏液體培養(yǎng)基中既有次生孢子產(chǎn)生又有菌絲存在，這也可能是在這5種培養(yǎng)基中產(chǎn)生次生孢子少的原因之一。

狗牙根黑粉菌的次生孢子形態(tài)有3種，第1種形態(tài)見(jiàn)圖6-A，這種次生孢子小而細(xì)，9種液體培養(yǎng)基除狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)外都產(chǎn)生這種類型孢子；第2種形態(tài)見(jiàn)圖6-B，由狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)產(chǎn)生，孢子個(gè)體大，中間間隔大，細(xì)胞質(zhì)分布不均一；第3種形態(tài)見(jiàn)圖6-C，孢子有莢膜，此類孢子只在狗牙根干草馬鈴薯酵母膏液體中培養(yǎng)產(chǎn)生，在其他液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中均無(wú)再生能力，其原因還有待進(jìn)一步研究。

3結(jié)論與討論

綜合結(jié)果與分析得出以下結(jié)論：（1）溫度為23～28℃、光照與黑暗間隔12h、pH值為5～7的條件最適合狗牙根黑粉菌冬孢子萌發(fā)；（2）冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生先菌絲，一端萌發(fā)或兩端同時(shí)萌發(fā)，先菌絲上側(cè)生擔(dān)孢子；（3）9種培養(yǎng)基均能產(chǎn)孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大，存在3種不同形態(tài)的次生孢子。

冬孢子從形成到萌發(fā)需要經(jīng)歷后熟期、休眠期、復(fù)蘇期和萌發(fā)期4個(gè)時(shí)期，光照是打破冬孢子休眠的重要條件。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，光照對(duì)狗牙根黑粉菌冬孢子的萌發(fā)并不是必要條件，這與水稻黑粉菌冬孢子在黑暗條件下不能萌發(fā)不同[7]，說(shuō)明可能不同黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)光的需求不同，但本研究中12h光暗交替培養(yǎng)能促進(jìn)冬孢子萌發(fā)。水分是打破冬孢子休眠期進(jìn)入復(fù)蘇期的必要條件，但本試驗(yàn)中未浸水的冬孢子在PSA平板上也能萌發(fā)，這可能與筆者采用冬孢子的保存方式（紙包）有關(guān)。溫度是影響冬孢子萌發(fā)的重要因素之一，狗牙根黑粉菌冬孢子在15～38℃都能萌發(fā)，其中以溫度為23℃左右萌發(fā)率最高，這與水稻黑粉菌和玉米瘤黑粉菌冬孢子的萌發(fā)溫度[7，9]較一致，與玉米絲黑穗病原菌冬孢子的最佳萌發(fā)溫度為28℃[10]不同。pH值對(duì)冬孢子的萌發(fā)影響很大，弱酸性至中性環(huán)境有利于冬孢子萌發(fā)（pH值5～7），偏堿性環(huán)境不利于冬孢子萌發(fā)。這與酸性條件促進(jìn)玉米瘤黑粉菌冬孢子、美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)的結(jié)果[9，11]較為接近。本試驗(yàn)中冬孢子萌發(fā)率偏低，可能與部分冬孢子因光照不足而沒(méi)有完成后熟作用以及試驗(yàn)過(guò)程中使用了表面消毒劑等有關(guān)。

狗牙根黑穗病是一種苗期侵染、花期發(fā)病的病害，國(guó)內(nèi)對(duì)該病病原菌的研究鮮有報(bào)道，國(guó)外的研究顯示狗牙根黑粉菌通過(guò)來(lái)自種皮或土壤越冬孢子的菌絲侵染發(fā)芽種子的胚芽鞘，并擴(kuò)散至整個(gè)植物組織；但對(duì)狗牙根黑粉菌冬孢子的生物學(xué)特性及其具體的侵染過(guò)程、致病機(jī)理都未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)9種液體培養(yǎng)基的產(chǎn)孢對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，9種培養(yǎng)基均能產(chǎn)孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較大，麩皮液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最小。說(shuō)明狗牙根黑粉菌產(chǎn)次生孢子對(duì)培養(yǎng)基要求不嚴(yán)，這與水稻黑粉菌[7]不同，也為進(jìn)一步研究該病原菌致病機(jī)理以及與寄主的互作提供了有力保障。筆者還發(fā)現(xiàn)，狗牙根黑粉菌存在3種不同形態(tài)的次生孢子，其中帶莢膜的次生孢子無(wú)活性，其原因還有待于進(jìn)一步研究。

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2結(jié)果與分析

2.1不同因素對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

2.1.1光照條件對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，光照、黑暗條件下，狗牙根黑粉菌冬孢子都能萌發(fā)，且光照能促進(jìn)冬孢子萌發(fā)。持續(xù)光照培養(yǎng)的冬孢子萌發(fā)率為31%，光照與黑暗間隔12h培養(yǎng)的萌發(fā)率為40%，持續(xù)黑暗培養(yǎng)萌發(fā)率為27%左右，說(shuō)明在自然光周期條件下萌發(fā)較好，這與玉米瘤黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)光的需求[9]一致。

2.1.2水分條件對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，冬孢子浸泡0～72h都能萌發(fā)，且浸泡48h的孢子萌發(fā)率最高；在0～48h范圍內(nèi)隨著浸水時(shí)間延長(zhǎng)，冬孢子的萌發(fā)率有所提高。與水稻黑粉菌冬孢子要浸泡24h才能萌發(fā)相比，狗牙根黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)水分的需求更低，這可能與在干燥器內(nèi)保存比在室內(nèi)紙袋中保存冬孢子散失的水分更多有關(guān)[7]。然而，一直浸泡在無(wú)菌水中的冬孢子萌發(fā)率有所降低，這可能與水中氧氣含量低，不能滿足冬孢子萌發(fā)對(duì)氧氣的需求有關(guān)。這與玉米瘤黑粉菌及水稻黑粉菌冬孢子試驗(yàn)的結(jié)果[7，9]相似。

2.1.3溫度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

圖1顯示，在15～38℃范圍內(nèi)，冬孢子都能萌發(fā)。在18～33℃下，冬孢子都能較好地萌發(fā)，其中23℃左右最適合冬孢子萌發(fā)，此時(shí)在PSA平板上培養(yǎng)16h的孢子萌發(fā)率高達(dá)53%，培養(yǎng)36h時(shí)萌發(fā)的孢子已長(zhǎng)成大菌落，無(wú)法再統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，此時(shí)肉眼可見(jiàn)白色菌落，說(shuō)明狗牙根冬孢子萌發(fā)非常快。

2.1.4pH值對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響圖2顯示，在pH值為4～10的范圍內(nèi)，冬孢子均可以萌發(fā)；在pH值為5～7時(shí)，冬孢子萌發(fā)率較高?？梢?jiàn)偏堿性環(huán)境不利于冬孢子萌發(fā)。

2.2狗牙根黑粉菌冬孢子形態(tài)及萌發(fā)過(guò)程

圖3顯示，狗牙根黑粉菌冬孢子淡褐色或棕色，近球形或卵形，直徑為7～9μm，膜面光滑而薄，這與程建斌的描述[3]相符。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，冬孢子培養(yǎng)6h后開(kāi)始萌發(fā)，24h后呈樹(shù)枝狀；冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生先菌絲，一端萌發(fā)或兩端同時(shí)萌發(fā)，先菌絲上側(cè)生擔(dān)孢子；先菌絲有隔，偶見(jiàn)長(zhǎng)先菌絲，長(zhǎng)先菌絲上不產(chǎn)生擔(dān)孢子，短先菌絲上擔(dān)孢子多形成樹(shù)枝狀。

2.3LHL1菌株的形態(tài)特征

冬孢子在PSA平板上萌發(fā)后形成雪花樣白色菌落，從菌落中挑取單菌落進(jìn)行分離培養(yǎng)得到菌株LHL1。菌株LHL1在PSA平板上28℃光照培養(yǎng)2周后，菌落直徑達(dá)到1.4cm左右，近圓形，邊緣整齊，正面乳白色，質(zhì)地近緊密為一薄層，背面黃褐色（圖4-A）。顯微鏡下LHL1菌為長(zhǎng)條形，一端膨大，一端細(xì)長(zhǎng)，分裂生長(zhǎng)（圖4-B）。

2.4不同液體培養(yǎng)基對(duì)LHL1生物量及產(chǎn)孢的影響

如圖5所示，9種液體培養(yǎng)基以馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基生物量最大，其他從大到小依次為4%葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基、2%甘油酵母膏液體培養(yǎng)基、完全液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基、玉米粉液體培養(yǎng)基、燕麥液體培養(yǎng)基、狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)、麩皮液體培養(yǎng)基。圖5還顯示，9種液體培養(yǎng)基均能夠產(chǎn)生次生孢子，但不同培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量和孢子形態(tài)不同，其中馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大，玉米粉液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最小。在燕麥、玉米粉、麩皮、完全及甘油酵母膏液體培養(yǎng)基中既有次生孢子產(chǎn)生又有菌絲存在，這也可能是在這5種培養(yǎng)基中產(chǎn)生次生孢子少的原因之一。

狗牙根黑粉菌的次生孢子形態(tài)有3種，第1種形態(tài)見(jiàn)圖6-A，這種次生孢子小而細(xì)，9種液體培養(yǎng)基除狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)外都產(chǎn)生這種類型孢子；第2種形態(tài)見(jiàn)圖6-B，由狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)產(chǎn)生，孢子個(gè)體大，中間間隔大，細(xì)胞質(zhì)分布不均一；第3種形態(tài)見(jiàn)圖6-C，孢子有莢膜，此類孢子只在狗牙根干草馬鈴薯酵母膏液體中培養(yǎng)產(chǎn)生，在其他液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中均無(wú)再生能力，其原因還有待進(jìn)一步研究。

3結(jié)論與討論

綜合結(jié)果與分析得出以下結(jié)論：（1）溫度為23～28℃、光照與黑暗間隔12h、pH值為5～7的條件最適合狗牙根黑粉菌冬孢子萌發(fā)；（2）冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生先菌絲，一端萌發(fā)或兩端同時(shí)萌發(fā)，先菌絲上側(cè)生擔(dān)孢子；（3）9種培養(yǎng)基均能產(chǎn)孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大，存在3種不同形態(tài)的次生孢子。

冬孢子從形成到萌發(fā)需要經(jīng)歷后熟期、休眠期、復(fù)蘇期和萌發(fā)期4個(gè)時(shí)期，光照是打破冬孢子休眠的重要條件。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，光照對(duì)狗牙根黑粉菌冬孢子的萌發(fā)并不是必要條件，這與水稻黑粉菌冬孢子在黑暗條件下不能萌發(fā)不同[7]，說(shuō)明可能不同黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)光的需求不同，但本研究中12h光暗交替培養(yǎng)能促進(jìn)冬孢子萌發(fā)。水分是打破冬孢子休眠期進(jìn)入復(fù)蘇期的必要條件，但本試驗(yàn)中未浸水的冬孢子在PSA平板上也能萌發(fā)，這可能與筆者采用冬孢子的保存方式（紙包）有關(guān)。溫度是影響冬孢子萌發(fā)的重要因素之一，狗牙根黑粉菌冬孢子在15～38℃都能萌發(fā)，其中以溫度為23℃左右萌發(fā)率最高，這與水稻黑粉菌和玉米瘤黑粉菌冬孢子的萌發(fā)溫度[7，9]較一致，與玉米絲黑穗病原菌冬孢子的最佳萌發(fā)溫度為28℃[10]不同。pH值對(duì)冬孢子的萌發(fā)影響很大，弱酸性至中性環(huán)境有利于冬孢子萌發(fā)（pH值5～7），偏堿性環(huán)境不利于冬孢子萌發(fā)。這與酸性條件促進(jìn)玉米瘤黑粉菌冬孢子、美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)的結(jié)果[9，11]較為接近。本試驗(yàn)中冬孢子萌發(fā)率偏低，可能與部分冬孢子因光照不足而沒(méi)有完成后熟作用以及試驗(yàn)過(guò)程中使用了表面消毒劑等有關(guān)。

狗牙根黑穗病是一種苗期侵染、花期發(fā)病的病害，國(guó)內(nèi)對(duì)該病病原菌的研究鮮有報(bào)道，國(guó)外的研究顯示狗牙根黑粉菌通過(guò)來(lái)自種皮或土壤越冬孢子的菌絲侵染發(fā)芽種子的胚芽鞘，并擴(kuò)散至整個(gè)植物組織；但對(duì)狗牙根黑粉菌冬孢子的生物學(xué)特性及其具體的侵染過(guò)程、致病機(jī)理都未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)9種液體培養(yǎng)基的產(chǎn)孢對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，9種培養(yǎng)基均能產(chǎn)孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較大，麩皮液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最小。說(shuō)明狗牙根黑粉菌產(chǎn)次生孢子對(duì)培養(yǎng)基要求不嚴(yán)，這與水稻黑粉菌[7]不同，也為進(jìn)一步研究該病原菌致病機(jī)理以及與寄主的互作提供了有力保障。筆者還發(fā)現(xiàn)，狗牙根黑粉菌存在3種不同形態(tài)的次生孢子，其中帶莢膜的次生孢子無(wú)活性，其原因還有待于進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：[HJ1.3mm]

[1]孫吉雄.草坪學(xué)[M].蘭州：甘肅科學(xué)技術(shù)出版社，1989：98-99.

[2]唐欣，向佐湘，蘇鵬.狗牙根研究進(jìn)展[J].作物研究，2009，23（增刊）：383-386.

[3]程建武.狗牙根黑穗病初報(bào)[J].中國(guó)草地，1992（1）：73.

[4]Garcia-GuzmanG，BurdonJ.ImpactoftheflowersmutUstilagocynodontis（Ustilaginaceae）ontheperformanceoftheclonalgrassCynodondactylon（Gramineae）[J].AmericanJournalofBotany，1997，84（11）：1565-1571.

[5]方中達(dá).植病研究方法[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1979：83-87.

[6]邱海萍，柴榮耀，張震，等.馬唐致病菌株Mds0404的生物學(xué)特性[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20（3）：163-167.

[7]陳勝軍，王艷麗，張震，等.稻粒黑粉菌冬孢子萌發(fā)影響因素及其產(chǎn)孢培養(yǎng)基的篩選[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（3）：572-576.

[8]Durieu-TrautmannO，TavlitzkiJ.ReversibleandpermanenteffectsofthecarbonsourcesandvariousantibioticsonthemorphologyandmetabolicpropertiesofUstilagocynodontiscells[J].TheJournalofCellBiology，1975，66（1）：102-113.

[9]劉正坪，趙占軍，張貴，等.玉米瘤黑粉病菌冬孢子生物學(xué)特性研究[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，1998，222（1）：12-13.

[10]劉洪亮，王險(xiǎn)峰，劉輝，等.玉米絲黑穗病原菌冬孢子萌發(fā)條件研究[J].中國(guó)植保導(dǎo)刊，2007，27（12）：5-8.

[11]徐蟬，張敬澤，王曉清，等.美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)條件的研究[J].長(zhǎng)江蔬菜，2012（16）：104-107.

2結(jié)果與分析

2.1不同因素對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

2.1.1光照條件對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，光照、黑暗條件下，狗牙根黑粉菌冬孢子都能萌發(fā)，且光照能促進(jìn)冬孢子萌發(fā)。持續(xù)光照培養(yǎng)的冬孢子萌發(fā)率為31%，光照與黑暗間隔12h培養(yǎng)的萌發(fā)率為40%，持續(xù)黑暗培養(yǎng)萌發(fā)率為27%左右，說(shuō)明在自然光周期條件下萌發(fā)較好，這與玉米瘤黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)光的需求[9]一致。

2.1.2水分條件對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，冬孢子浸泡0～72h都能萌發(fā)，且浸泡48h的孢子萌發(fā)率最高；在0～48h范圍內(nèi)隨著浸水時(shí)間延長(zhǎng)，冬孢子的萌發(fā)率有所提高。與水稻黑粉菌冬孢子要浸泡24h才能萌發(fā)相比，狗牙根黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)水分的需求更低，這可能與在干燥器內(nèi)保存比在室內(nèi)紙袋中保存冬孢子散失的水分更多有關(guān)[7]。然而，一直浸泡在無(wú)菌水中的冬孢子萌發(fā)率有所降低，這可能與水中氧氣含量低，不能滿足冬孢子萌發(fā)對(duì)氧氣的需求有關(guān)。這與玉米瘤黑粉菌及水稻黑粉菌冬孢子試驗(yàn)的結(jié)果[7，9]相似。

2.1.3溫度對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響

圖1顯示，在15～38℃范圍內(nèi)，冬孢子都能萌發(fā)。在18～33℃下，冬孢子都能較好地萌發(fā)，其中23℃左右最適合冬孢子萌發(fā)，此時(shí)在PSA平板上培養(yǎng)16h的孢子萌發(fā)率高達(dá)53%，培養(yǎng)36h時(shí)萌發(fā)的孢子已長(zhǎng)成大菌落，無(wú)法再統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率，此時(shí)肉眼可見(jiàn)白色菌落，說(shuō)明狗牙根冬孢子萌發(fā)非?？臁?/p>

2.1.4pH值對(duì)冬孢子萌發(fā)的影響圖2顯示，在pH值為4～10的范圍內(nèi)，冬孢子均可以萌發(fā)；在pH值為5～7時(shí)，冬孢子萌發(fā)率較高?？梢?jiàn)偏堿性環(huán)境不利于冬孢子萌發(fā)。

2.2狗牙根黑粉菌冬孢子形態(tài)及萌發(fā)過(guò)程

圖3顯示，狗牙根黑粉菌冬孢子淡褐色或棕色，近球形或卵形，直徑為7～9μm，膜面光滑而薄，這與程建斌的描述[3]相符。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，冬孢子培養(yǎng)6h后開(kāi)始萌發(fā)，24h后呈樹(shù)枝狀；冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生先菌絲，一端萌發(fā)或兩端同時(shí)萌發(fā)，先菌絲上側(cè)生擔(dān)孢子；先菌絲有隔，偶見(jiàn)長(zhǎng)先菌絲，長(zhǎng)先菌絲上不產(chǎn)生擔(dān)孢子，短先菌絲上擔(dān)孢子多形成樹(shù)枝狀。

2.3LHL1菌株的形態(tài)特征

冬孢子在PSA平板上萌發(fā)后形成雪花樣白色菌落，從菌落中挑取單菌落進(jìn)行分離培養(yǎng)得到菌株LHL1。菌株LHL1在PSA平板上28℃光照培養(yǎng)2周后，菌落直徑達(dá)到1.4cm左右，近圓形，邊緣整齊，正面乳白色，質(zhì)地近緊密為一薄層，背面黃褐色（圖4-A）。顯微鏡下LHL1菌為長(zhǎng)條形，一端膨大，一端細(xì)長(zhǎng)，分裂生長(zhǎng)（圖4-B）。

2.4不同液體培養(yǎng)基對(duì)LHL1生物量及產(chǎn)孢的影響

如圖5所示，9種液體培養(yǎng)基以馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基生物量最大，其他從大到小依次為4%葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基、2%甘油酵母膏液體培養(yǎng)基、完全液體培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基、玉米粉液體培養(yǎng)基、燕麥液體培養(yǎng)基、狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)、麩皮液體培養(yǎng)基。圖5還顯示，9種液體培養(yǎng)基均能夠產(chǎn)生次生孢子，但不同培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量和孢子形態(tài)不同，其中馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大，玉米粉液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最小。在燕麥、玉米粉、麩皮、完全及甘油酵母膏液體培養(yǎng)基中既有次生孢子產(chǎn)生又有菌絲存在，這也可能是在這5種培養(yǎng)基中產(chǎn)生次生孢子少的原因之一。

狗牙根黑粉菌的次生孢子形態(tài)有3種，第1種形態(tài)見(jiàn)圖6-A，這種次生孢子小而細(xì)，9種液體培養(yǎng)基除狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)外都產(chǎn)生這種類型孢子；第2種形態(tài)見(jiàn)圖6-B，由狗牙根干草酵母膏液體培養(yǎng)產(chǎn)生，孢子個(gè)體大，中間間隔大，細(xì)胞質(zhì)分布不均一；第3種形態(tài)見(jiàn)圖6-C，孢子有莢膜，此類孢子只在狗牙根干草馬鈴薯酵母膏液體中培養(yǎng)產(chǎn)生，在其他液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中均無(wú)再生能力，其原因還有待進(jìn)一步研究。

3結(jié)論與討論

綜合結(jié)果與分析得出以下結(jié)論：（1）溫度為23～28℃、光照與黑暗間隔12h、pH值為5～7的條件最適合狗牙根黑粉菌冬孢子萌發(fā)；（2）冬孢子萌發(fā)產(chǎn)生先菌絲，一端萌發(fā)或兩端同時(shí)萌發(fā)，先菌絲上側(cè)生擔(dān)孢子；（3）9種培養(yǎng)基均能產(chǎn)孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最大，存在3種不同形態(tài)的次生孢子。

冬孢子從形成到萌發(fā)需要經(jīng)歷后熟期、休眠期、復(fù)蘇期和萌發(fā)期4個(gè)時(shí)期，光照是打破冬孢子休眠的重要條件。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，光照對(duì)狗牙根黑粉菌冬孢子的萌發(fā)并不是必要條件，這與水稻黑粉菌冬孢子在黑暗條件下不能萌發(fā)不同[7]，說(shuō)明可能不同黑粉菌冬孢子萌發(fā)對(duì)光的需求不同，但本研究中12h光暗交替培養(yǎng)能促進(jìn)冬孢子萌發(fā)。水分是打破冬孢子休眠期進(jìn)入復(fù)蘇期的必要條件，但本試驗(yàn)中未浸水的冬孢子在PSA平板上也能萌發(fā)，這可能與筆者采用冬孢子的保存方式（紙包）有關(guān)。溫度是影響冬孢子萌發(fā)的重要因素之一，狗牙根黑粉菌冬孢子在15～38℃都能萌發(fā)，其中以溫度為23℃左右萌發(fā)率最高，這與水稻黑粉菌和玉米瘤黑粉菌冬孢子的萌發(fā)溫度[7，9]較一致，與玉米絲黑穗病原菌冬孢子的最佳萌發(fā)溫度為28℃[10]不同。pH值對(duì)冬孢子的萌發(fā)影響很大，弱酸性至中性環(huán)境有利于冬孢子萌發(fā)（pH值5～7），偏堿性環(huán)境不利于冬孢子萌發(fā)。這與酸性條件促進(jìn)玉米瘤黑粉菌冬孢子、美味黑粉菌冬孢子萌發(fā)的結(jié)果[9，11]較為接近。本試驗(yàn)中冬孢子萌發(fā)率偏低，可能與部分冬孢子因光照不足而沒(méi)有完成后熟作用以及試驗(yàn)過(guò)程中使用了表面消毒劑等有關(guān)。

狗牙根黑穗病是一種苗期侵染、花期發(fā)病的病害，國(guó)內(nèi)對(duì)該病病原菌的研究鮮有報(bào)道，國(guó)外的研究顯示狗牙根黑粉菌通過(guò)來(lái)自種皮或土壤越冬孢子的菌絲侵染發(fā)芽種子的胚芽鞘，并擴(kuò)散至整個(gè)植物組織；但對(duì)狗牙根黑粉菌冬孢子的生物學(xué)特性及其具體的侵染過(guò)程、致病機(jī)理都未見(jiàn)報(bào)道。

通過(guò)9種液體培養(yǎng)基的產(chǎn)孢對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，9種培養(yǎng)基均能產(chǎn)孢，以4%葡萄糖酵母膏、馬鈴薯葡萄糖、馬鈴薯蔗糖3種液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較大，麩皮液體培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最小。說(shuō)明狗牙根黑粉菌產(chǎn)次生孢子對(duì)培養(yǎng)基要求不嚴(yán)，這與水稻黑粉菌[7]不同，也為進(jìn)一步研究該病原菌致病機(jī)理以及與寄主的互作提供了有力保障。筆者還發(fā)現(xiàn)，狗牙根黑粉菌存在3種不同形態(tài)的次生孢子，其中帶莢膜的次生孢子無(wú)活性，其原因還有待于進(jìn)一步研究。

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[8]Durieu-TrautmannO，TavlitzkiJ.ReversibleandpermanenteffectsofthecarbonsourcesandvariousantibioticsonthemorphologyandmetabolicpropertiesofUstilagocynodontiscells[J].TheJournalofCellBiology，1975，66（1）：102-113.

[9]劉正坪，趙占軍，張貴，等.玉米瘤黑粉病菌冬孢子生物學(xué)特性研究[J].現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)，1998，222（1）：12-13.

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