秋水仙胺誘導(dǎo)牛卵母細胞顯核的研究

王士勇+楊月春+鄭軍軍+劉宗岳+方大雨+楊福合??

摘要：為了觀察秋水仙胺（demecolcine，DEME）誘導(dǎo)牛卵母細胞的顯核效果，從吉林省長春市某屠宰場收集牛卵巢后采用抽吸法獲取卵泡液，在體視顯微鏡下選擇卵丘完整、胞質(zhì)均勻的卵丘-卵母細胞復(fù)合體（COCs），微滴法體外成熟（invitromature，IVM）培養(yǎng)19～22h，在0.3%透明質(zhì)酸酶中旋渦振蕩去除卵母細胞周圍的卵丘細胞，挑選排出第一極體的卵母細胞隨機分組，分別進行DEME濃度和作用時間誘導(dǎo)牛卵母細胞顯核的研究。結(jié)果表明，DEME處理60、90、120min組間顯核率差異不顯著（P>0.05），但是60、120min組的顯核率顯著高于DEME處理30min組（P<0.05）。當DEME濃度為0.5μg/mL時，顯核率最高，為78.9%，顯著高于0.3、0.4μg/mL組（P<0.05），但是與0.6μg/mL組差異不顯著（P>0.05）。牛的COCs經(jīng)IVM培養(yǎng)19、20、21、22h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)22h組顯核率最高，顯著高于培養(yǎng)19h組（P<0.05），但是與培養(yǎng)20、21h組差異不顯著（P>0.05）?？梢娕Ｂ涯讣毎?jīng)IVM培養(yǎng)20～22h后，用0.5μg/mLDEME處理60min可以有效誘導(dǎo)其顯核。

關(guān)鍵詞：地美可辛；牛；卵母細胞；體外成熟；化學輔助去核

中圖分類號：S823.2文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2014）11-0228-03

自1997年第1只體細胞核移植動物——“多莉”誕生[1]以來，體細胞核移植技術(shù)已經(jīng)發(fā)展十幾年的時間，由于其在核質(zhì)互作、瀕危動物保護方面具有深遠的應(yīng)用前景[2]，同時可利用的大量瀕危動物卵母細胞通常很難獲得，而屠宰場屠宰后的母牛卵巢方便獲取且易獲得大量卵母細胞作為受體胞質(zhì)，利用其進行種間體細胞核移植技術(shù)研究在當前較廣泛。但是包括牛在內(nèi)的家畜卵母細胞不像鼠科動物的卵母細胞在光學顯微鏡下可以直接看到細胞核[3]，所以通常去核時采用盲吸法[4]、熒光輔助法[5]或秋水仙胺（demecolcine，DEME）誘導(dǎo)顯核法[6]。利用盲吸法去核時為了提高去核效率通常要去除較大體積的胞質(zhì)，之后還需要在紫外光下照射以確定去核成功率，這會給受體胞質(zhì)造成不可逆的傷害，而熒光輔助法去核法同樣需要對卵母細胞進行紫外光照射，具有同樣或更重的傷害[7]。DEME誘導(dǎo)顯核法利用DEME對受體卵母細胞處理后能夠破壞其微管穩(wěn)定性、干擾染色體的正常分離和紡錘體的功能促進核內(nèi)所有染色質(zhì)聚集在胞質(zhì)表面形成一個突起，去核時僅去除極少量的胞質(zhì)即可達到完全去核的目的，去核后在沒有DEME的培養(yǎng)液中培養(yǎng)時即可恢復(fù)微管的聚集[8]。本試驗就牛卵母細胞經(jīng)過微滴法體外成熟（invitromature，IVM）不同時間后用DEME處理對其顯核情況進行研究，旨在確定DEME誘導(dǎo)去核時的適宜濃度和處理時間，以滿足體細胞核移植研究需要，為其進一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑

DEME和丙酮酸鈉購自西格瑪奧德里奇公司，人絨毛促性腺激素（hCG）和孕馬血清促性腺激素（PMSG）購自浙江省寧波市三生藥業(yè)有限公司，其余試劑均購自生命科技公司。

1.2卵巢的獲取及卵母細胞的收集

卵巢采集于吉林省長春市某屠宰場，母牛屠宰后立即采取卵巢將其放入含有雙抗的25～35℃生理鹽水中，8h內(nèi)帶回實驗室。將收集的卵巢剪去附著的系膜和輸卵管，用滅菌生理鹽水清洗3次后，用帶有16號針頭的10mL注射器抽吸法收集卵泡液，在體視顯微鏡下選擇卵丘完整、胞質(zhì)均勻的卵丘-卵母細胞復(fù)合體（cumulus-oocyte-complexes，COCs）用含5%FBS的PBS洗凈。

1.3卵母細胞體外成熟

將挑選好的COCs用成熟液洗3次，然后移入平衡2h以上的微滴成熟液中，放入38.5℃、飽和濕度、5%CO2條件下培養(yǎng)。卵母細胞成熟培養(yǎng)液組成為90%M199+10%FBS+10μg/mLPMSG+10μg/mLhCG+0.33mmol/L丙酮酸鈉，成熟培養(yǎng)19～22h后置于含3mg/mL透明質(zhì)酸酶的DPBS中，渦旋混合器振蕩去掉卵母細胞周圍的卵丘細胞，檢查成熟情況，以體視顯微鏡下觀察到卵丘細胞擴展（圖1）及排出第一極體（圖2）視為成熟。

1.4試驗設(shè)計

試驗一：IVM培養(yǎng)21h后，挑選成熟的卵母細胞隨機分組，洗凈后放入含0.4μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培養(yǎng)液中，在38.5℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30、60、90、120min，在體視顯微鏡下觀察顯核情況（圖3）。

試驗二：IVM培養(yǎng)21h后，挑選成熟的卵母細胞隨機分組，洗凈后放入含0.3、0.4、0.5、0.6μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培養(yǎng)液中，在38.5℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min，在體視顯微鏡下觀察顯核情況（圖3）。

試驗三：IVM培養(yǎng)19～22h后，挑選成熟的卵母細胞洗凈后放入含0.5μg/mLDEME和10%FBS的M199微滴培養(yǎng)液中，在38.5℃、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min，在體視顯微鏡下觀察顯核情況（圖3）。

1.5統(tǒng)計分析

結(jié)果以“平均值±標準差”表示，數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS21.0軟件進行方差分析和多重比較，差異顯著標準為α=0.05。

2結(jié)果與分析

2.1DEME處理時間對牛卵母細胞顯核效果的影響

牛卵母細胞經(jīng)0.4μg/mLDEME處理不同時間之后，顯核結(jié)果如表1所示，60、90、120min組間顯核率差異不顯著（P>0.05），但是60、120min組的顯核率顯著高于30min組（P<0.05）。

2.2DEME濃度對牛卵母細胞顯核效果的影響

牛卵母細胞經(jīng)不同濃度DEME處理60min之后，顯核結(jié)果如表2所示，當DEME的濃度為0.5μg/mL時，顯核率最高，為78.9%，顯著高于0.3、0.4μg/mL組（P<0.05），但是與0.6μg/mL組差異不顯著（P>0.05）。endprint

2.3IVM時間對DEME誘導(dǎo)牛卵母細胞顯核效果的影響

牛COCs經(jīng)IVM不同時間之后，DEME誘導(dǎo)顯核結(jié)果如表3所示，其中19h組顯核率最低，且顯著低于21、22h組（P<0.05），但是與20h組差異不顯著（P>0.05）；22h組顯核率最高，與20、21h組差異不顯著（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

體細胞核移植技術(shù)的一個關(guān)鍵步驟就是受體卵母細胞的去核，去核的成功率直接影響核移植的整體效率，傳統(tǒng)的盲吸法對操作者的技術(shù)熟練水平要求較高，并且去除胞質(zhì)較多，不利于核移植胚胎后期的發(fā)育。利用DEME進行化學誘導(dǎo)去核不僅去除胞質(zhì)量較少，而且化學誘導(dǎo)劑作用時間較短，所以對核移植胚胎的后期發(fā)育并無明顯不良影響，近年來成為采用較多的一種主流方法。應(yīng)用DEME誘導(dǎo)去核通常采用2種方式：一種是將激活處理后的卵母細胞在一定濃度的DEME中處理相應(yīng)的時間，使同源染色體隨著第二極體排出胞質(zhì)，這種方式在小鼠[9]、山羊[9]、兔[10]、牛[11]上都有研究報道；另一種是將減數(shù)第二次分裂中期卵母細胞經(jīng)過DEME處理后，染色質(zhì)在卵母細胞胞質(zhì)表面形成一個包狀的突起，在顯微鏡下利用顯微操作去掉突起，同樣可以達到去核的目的，主要應(yīng)用在豬[6]、牛[12]等家畜方面。

DEME誘導(dǎo)去核的方法在不同動物和不同試驗體系下所采用的濃度及作用時間各不相同，Russell等報道，在牛上用DEME誘導(dǎo)去核時采用0.6μg/mL濃度處理90min較好[7]；Meng等采用0.4μg/mL濃度處理30～40min較好[3]，而本研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.5μg/mL時顯核率最高，且顯著高于0.4μg/mL組（P<0.05），這與王強等在小鼠上的研究結(jié)果[13]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理時間延長，有些在前段時間沒有胞質(zhì)突起的在后來會出現(xiàn)胞質(zhì)突起，所以筆者認為化學誘導(dǎo)去核作為一種輔助的手段在實際應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)各自的試驗條件探索適宜體系，一般進行體細胞核移植研究時都會根據(jù)受體卵母細胞數(shù)量而進行多批次的去核操作，這樣就可以分別在30、60、90min等時間點（或根據(jù)試驗進度）多次挑選具有胞質(zhì)突起的卵母細胞進行去核操作。

由于卵母細胞的細胞核位置會隨著IVM時間的延長而遠離第一極體[14]，所以筆者研究了IVM時間對DEME誘導(dǎo)牛卵母細胞顯核效果的影響，結(jié)果顯示22h組顯核率最高，但是與20、21h組差異不顯著（P>0.05），說明在牛卵母細胞IVM20～22h這段時間里進行DEME處理效果較適宜，同時在試驗過程中發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，DEME誘導(dǎo)的胞質(zhì)突起距離第一極體較遠的概率增高，這與李裕強等的報道[14-15]一致。

參考文獻：

[1]WilmutI，SchniekeAE，McwhirJ，etal.Viableoffspringderivedfromfetalandadultmammaliancells[J].Nature，1997，385（6619）：810-813.[HJ1.82mm]

[2]KaedeiY，F(xiàn)ujiwaraA，TaniharaF，etal.Invitrodevelopmentofcatinterspeciesnucleartransferusingpigsandcowscytoplasm[J].BulletinoftheVeterinaryInstituteinPulawy，2010，54（3）：405-408.

[3]MengQG，WuX，BunchTD，etal.Enucleationofdemecolcine-treatedbovineoocytesincytochalasin-freemedium：mechanisminvestigationandpracticalimprovement[J].CellularReprogramming，2011，13（5）：411-418.

[4]LorthongpanichC，LaowtammathronC，ChanAW，etal.Developmentofinterspeciesclonedmonkeyembryosreconstructedwithbovineenucleatedoocytes[J].TheJournalofReproductionandDevelopment，2008，54（5）：306-313.

[5]BordignonV，SmithLC.Telophaseenucleation：animprovedmethodtopreparerecipientcytoplastsforuseinbovinenucleartransfer[J].MolecularReproductionandDevelopment，1998，49（1）：29-36.

[6]YinXJ，TaniT，YonemuraI，etal.Productionofclonedpigsfromadultsomaticcellsbychemicallyassistedremovalofmaternalchromosomes[J].BiologyofReproduction，2002，67（2）：442-446.

[7]RussellDF，IbáezE，AlbertiniDF，etal.Activatedbovinecytoplastspreparedbydemecolcine-inducedenucleationsupportdevelopmentofnucleartransferembryosinvitro[J].MolecularReproductionandDevelopment，2005，72（2）：161-170.

[8]Costa-BorgesN，ParamioMT，CalderónG，etal.Antimitotictreatmentsforchemicallyassistedoocyteenucleationinnucleartransferprocedures[J].CloningandStemCells，2009，11（1）：153-166.

[9]Costa-BorgesN，ParamioMT，SantalóJ，etal.Demecolcine-andnocodazole-inducedenucleationinmouseandgoatoocytesforthepreparationofrecipientcytoplastsinsomaticcellnucleartransferprocedures[J].Theriogenology，2011，75（3）：527-541.

[10]YinXJ，KatoY，TsunodaY.Effectofenucleationproceduresandmaturationconditionsonthedevelopmentofnuclear-transferredrabbitoocytesreceivingmalefibroblastcells[J].Reproduction，2002，124（1）：41-47.

[11]王玉涵，朱玉霞，尹多，等.化學輔助去核法對延邊黃牛卵母細胞去核率及其重構(gòu)胚發(fā)育率的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2011，33（2）：340-344.

[12]SongK，HyunSH，ShinT，etal.Post-activationtreatmentwithdemecolcineimprovesdevelopmentofsomaticcellnucleartransferembryosinpigsbymodifyingtheremodelingofdonornuclei[J].MolecularReproductionandDevelopment，2009，76（7）：611-619.

[13]王強，安志興，顧玲，等.脫羰秋水仙堿誘導(dǎo)昆明白小鼠卵母細胞去核的研究[J].遺傳，2004，26（5）：653-657.

[14]李裕強，張琇，安志興，等.牛卵母細胞的去核與激活[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2004，32（11）：6-10.

[15]嚴興榮，雷安民，沈文正，等.小鼠不同卵齡卵母胞細紡錘體位置及對去核效率的影響[J].中國農(nóng)學通報，2005，21（5）：9-12.endprint

2.3IVM時間對DEME誘導(dǎo)牛卵母細胞顯核效果的影響

牛COCs經(jīng)IVM不同時間之后，DEME誘導(dǎo)顯核結(jié)果如表3所示，其中19h組顯核率最低，且顯著低于21、22h組（P<0.05），但是與20h組差異不顯著（P>0.05）；22h組顯核率最高，與20、21h組差異不顯著（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

體細胞核移植技術(shù)的一個關(guān)鍵步驟就是受體卵母細胞的去核，去核的成功率直接影響核移植的整體效率，傳統(tǒng)的盲吸法對操作者的技術(shù)熟練水平要求較高，并且去除胞質(zhì)較多，不利于核移植胚胎后期的發(fā)育。利用DEME進行化學誘導(dǎo)去核不僅去除胞質(zhì)量較少，而且化學誘導(dǎo)劑作用時間較短，所以對核移植胚胎的后期發(fā)育并無明顯不良影響，近年來成為采用較多的一種主流方法。應(yīng)用DEME誘導(dǎo)去核通常采用2種方式：一種是將激活處理后的卵母細胞在一定濃度的DEME中處理相應(yīng)的時間，使同源染色體隨著第二極體排出胞質(zhì)，這種方式在小鼠[9]、山羊[9]、兔[10]、牛[11]上都有研究報道；另一種是將減數(shù)第二次分裂中期卵母細胞經(jīng)過DEME處理后，染色質(zhì)在卵母細胞胞質(zhì)表面形成一個包狀的突起，在顯微鏡下利用顯微操作去掉突起，同樣可以達到去核的目的，主要應(yīng)用在豬[6]、牛[12]等家畜方面。

DEME誘導(dǎo)去核的方法在不同動物和不同試驗體系下所采用的濃度及作用時間各不相同，Russell等報道，在牛上用DEME誘導(dǎo)去核時采用0.6μg/mL濃度處理90min較好[7]；Meng等采用0.4μg/mL濃度處理30～40min較好[3]，而本研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.5μg/mL時顯核率最高，且顯著高于0.4μg/mL組（P<0.05），這與王強等在小鼠上的研究結(jié)果[13]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理時間延長，有些在前段時間沒有胞質(zhì)突起的在后來會出現(xiàn)胞質(zhì)突起，所以筆者認為化學誘導(dǎo)去核作為一種輔助的手段在實際應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)各自的試驗條件探索適宜體系，一般進行體細胞核移植研究時都會根據(jù)受體卵母細胞數(shù)量而進行多批次的去核操作，這樣就可以分別在30、60、90min等時間點（或根據(jù)試驗進度）多次挑選具有胞質(zhì)突起的卵母細胞進行去核操作。

由于卵母細胞的細胞核位置會隨著IVM時間的延長而遠離第一極體[14]，所以筆者研究了IVM時間對DEME誘導(dǎo)牛卵母細胞顯核效果的影響，結(jié)果顯示22h組顯核率最高，但是與20、21h組差異不顯著（P>0.05），說明在牛卵母細胞IVM20～22h這段時間里進行DEME處理效果較適宜，同時在試驗過程中發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，DEME誘導(dǎo)的胞質(zhì)突起距離第一極體較遠的概率增高，這與李裕強等的報道[14-15]一致。

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[3]MengQG，WuX，BunchTD，etal.Enucleationofdemecolcine-treatedbovineoocytesincytochalasin-freemedium：mechanisminvestigationandpracticalimprovement[J].CellularReprogramming，2011，13（5）：411-418.

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[8]Costa-BorgesN，ParamioMT，CalderónG，etal.Antimitotictreatmentsforchemicallyassistedoocyteenucleationinnucleartransferprocedures[J].CloningandStemCells，2009，11（1）：153-166.

[9]Costa-BorgesN，ParamioMT，SantalóJ，etal.Demecolcine-andnocodazole-inducedenucleationinmouseandgoatoocytesforthepreparationofrecipientcytoplastsinsomaticcellnucleartransferprocedures[J].Theriogenology，2011，75（3）：527-541.

[10]YinXJ，KatoY，TsunodaY.Effectofenucleationproceduresandmaturationconditionsonthedevelopmentofnuclear-transferredrabbitoocytesreceivingmalefibroblastcells[J].Reproduction，2002，124（1）：41-47.

[11]王玉涵，朱玉霞，尹多，等.化學輔助去核法對延邊黃牛卵母細胞去核率及其重構(gòu)胚發(fā)育率的影響[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2011，33（2）：340-344.

[12]SongK，HyunSH，ShinT，etal.Post-activationtreatmentwithdemecolcineimprovesdevelopmentofsomaticcellnucleartransferembryosinpigsbymodifyingtheremodelingofdonornuclei[J].MolecularReproductionandDevelopment，2009，76（7）：611-619.

[13]王強，安志興，顧玲，等.脫羰秋水仙堿誘導(dǎo)昆明白小鼠卵母細胞去核的研究[J].遺傳，2004，26（5）：653-657.

[14]李裕強，張琇，安志興，等.牛卵母細胞的去核與激活[J].西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2004，32（11）：6-10.

[15]嚴興榮，雷安民，沈文正，等.小鼠不同卵齡卵母胞細紡錘體位置及對去核效率的影響[J].中國農(nóng)學通報，2005，21（5）：9-12.endprint

2.3IVM時間對DEME誘導(dǎo)牛卵母細胞顯核效果的影響

牛COCs經(jīng)IVM不同時間之后，DEME誘導(dǎo)顯核結(jié)果如表3所示，其中19h組顯核率最低，且顯著低于21、22h組（P<0.05），但是與20h組差異不顯著（P>0.05）；22h組顯核率最高，與20、21h組差異不顯著（P>0.05）。

3結(jié)論與討論

體細胞核移植技術(shù)的一個關(guān)鍵步驟就是受體卵母細胞的去核，去核的成功率直接影響核移植的整體效率，傳統(tǒng)的盲吸法對操作者的技術(shù)熟練水平要求較高，并且去除胞質(zhì)較多，不利于核移植胚胎后期的發(fā)育。利用DEME進行化學誘導(dǎo)去核不僅去除胞質(zhì)量較少，而且化學誘導(dǎo)劑作用時間較短，所以對核移植胚胎的后期發(fā)育并無明顯不良影響，近年來成為采用較多的一種主流方法。應(yīng)用DEME誘導(dǎo)去核通常采用2種方式：一種是將激活處理后的卵母細胞在一定濃度的DEME中處理相應(yīng)的時間，使同源染色體隨著第二極體排出胞質(zhì)，這種方式在小鼠[9]、山羊[9]、兔[10]、牛[11]上都有研究報道；另一種是將減數(shù)第二次分裂中期卵母細胞經(jīng)過DEME處理后，染色質(zhì)在卵母細胞胞質(zhì)表面形成一個包狀的突起，在顯微鏡下利用顯微操作去掉突起，同樣可以達到去核的目的，主要應(yīng)用在豬[6]、牛[12]等家畜方面。

DEME誘導(dǎo)去核的方法在不同動物和不同試驗體系下所采用的濃度及作用時間各不相同，Russell等報道，在牛上用DEME誘導(dǎo)去核時采用0.6μg/mL濃度處理90min較好[7]；Meng等采用0.4μg/mL濃度處理30～40min較好[3]，而本研究發(fā)現(xiàn)濃度為0.5μg/mL時顯核率最高，且顯著高于0.4μg/mL組（P<0.05），這與王強等在小鼠上的研究結(jié)果[13]一致。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著處理時間延長，有些在前段時間沒有胞質(zhì)突起的在后來會出現(xiàn)胞質(zhì)突起，所以筆者認為化學誘導(dǎo)去核作為一種輔助的手段在實際應(yīng)用過程中應(yīng)根據(jù)各自的試驗條件探索適宜體系，一般進行體細胞核移植研究時都會根據(jù)受體卵母細胞數(shù)量而進行多批次的去核操作，這樣就可以分別在30、60、90min等時間點（或根據(jù)試驗進度）多次挑選具有胞質(zhì)突起的卵母細胞進行去核操作。

由于卵母細胞的細胞核位置會隨著IVM時間的延長而遠離第一極體[14]，所以筆者研究了IVM時間對DEME誘導(dǎo)牛卵母細胞顯核效果的影響，結(jié)果顯示22h組顯核率最高，但是與20、21h組差異不顯著（P>0.05），說明在牛卵母細胞IVM20～22h這段時間里進行DEME處理效果較適宜，同時在試驗過程中發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長，DEME誘導(dǎo)的胞質(zhì)突起距離第一極體較遠的概率增高，這與李裕強等的報道[14-15]一致。

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