煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)因子

潘梅+戚華莎+黃賽+王景飛+呂德任+符瑞侃

摘要：以煙葉唇柱苣苔無菌葉片為試驗(yàn)材料，研究培養(yǎng)基pH值、無機(jī)鹽濃度、蔗糖濃度、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及配比等對不定芽誘導(dǎo)的影響，以期篩選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基。結(jié)果表明：不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L，滅菌前pH值為6.0，40d不定芽誘導(dǎo)率為100%，不定芽數(shù)平均為9.58個/張，生長勢好。

關(guān)鍵詞：煙葉唇柱苣苔；葉片；不定芽；組織培養(yǎng)

中圖分類號：Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1002-1302（2014）11-0075-03

苦苣苔科植物具有極重要的生物學(xué)價值和分類意義[1]，其種類繁多，全世界約有150屬3000余種，我國有58屬約463種[2]，其中海南省約有13屬21種1變種，而特有種10種[3]。苦苣苔科植物中許多種類是重要的觀賞植物、藥用植物和特種蔬菜資源。煙葉唇柱苣苔（Chiritaheterotricha）是苦苣苔科唇柱苣苔屬多年生草本植物，生于海拔約430m的山谷林中或溪邊石上，是海南特有的野生花卉，其花冠淡紫色或白色，極為優(yōu)雅，而且花期長，四季長綠，適合觀賞和園藝。此外，唇柱苣苔屬植物具有廣泛的適應(yīng)性[4]，因而煙葉唇柱苣苔具有極大的開發(fā)潛力。目前，煙葉唇柱苣苔仍處于野生狀態(tài)，未進(jìn)行商品化開發(fā)。由于人類活動的干擾、生態(tài)環(huán)境惡化以及自身的原因，煙葉唇柱苣苔資源逐漸減少，因此極有必要進(jìn)行組織培養(yǎng)研究，以滿足煙葉唇柱苣苔的保護(hù)和開發(fā)利用的需要。本試驗(yàn)以煙葉唇柱苣苔無菌葉片作為材料，較系統(tǒng)地研究葉片分化不定芽過程中的若干影響因素，以期篩選出最佳的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)條件，快速建立煙葉唇柱苣苔組培技術(shù)體系。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

植株采自海南省保亭縣。取幼葉進(jìn)行表面消毒后培養(yǎng)獲得的無菌葉片作為試驗(yàn)材料。

1.2試驗(yàn)方法

在基本培養(yǎng)基中添加不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑，除試驗(yàn)項(xiàng)目以外，所有處理中的基本培養(yǎng)基中含食用蔗糖30g/L、卡拉膠9g/L，滅菌前pH值為6.0，光照強(qiáng)度1500lx，光照時間9h/d，培養(yǎng)溫度（26±2）℃。取無菌植株小葉片（約0.5cm×0.5cm），以葉面朝上接種于各種培養(yǎng)基上（圖1），每個處理接種8袋，每袋3張葉，3次重復(fù)，定期觀察并記錄，培養(yǎng)40d后統(tǒng)計(jì)葉片不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)。不定芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出芽葉片數(shù)/接種葉片數(shù)×100%，平均不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/誘導(dǎo)出芽葉片數(shù)。

1.2.1不同接種方式對不定芽誘導(dǎo)的影響以MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L為基本培養(yǎng)基，接種葉片分別以葉背和葉面平放于培養(yǎng)基上，共2種處理。

1.2.2pH值對不定芽誘導(dǎo)的影響以MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L為基本培養(yǎng)基，滅菌前pH值分別調(diào)至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，共5個處理。

1.2.3無機(jī)鹽濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響以1/4MS、2/4MS、3/4MS、MS作為基本培養(yǎng)基，各添加6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L，共4個處理。

1.2.4不同種類細(xì)胞分裂素對不定芽誘導(dǎo)的影響以MS+NAA0.1mg/L為基本培養(yǎng)基，分別添加6-BA0.1mg/L、KT0.1mg/L和TDZ0.1mg/L，共3個處理。

1.2.5蔗糖濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響以MS+6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L為基本培養(yǎng)基，設(shè)置蔗糖濃度10、20、30、40、50g/L共5個處理。

1.2.6不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導(dǎo)的影響以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)6-BA0.1、0.5、1.0mg/L與NAA0.1、0.5mg/L不同配比，共6個處理。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用方差分析法，F(xiàn)測驗(yàn)顯著后用新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1不同接種方式對不定芽誘導(dǎo)的影響

煙葉唇柱苣苔葉片幾乎無明顯的愈傷組織分化，可以直接分化出不定芽。接種15d后，葉面開始膨大隆起，25d開始有小芽點(diǎn)萌動，40d在葉片邊緣、主葉脈基部和葉面處均分化出不定芽。從表1可見，以葉背和葉面2種方式接種培養(yǎng)的結(jié)果差異極大，以葉背接觸培養(yǎng)基的葉片不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)100%，平均不定芽數(shù)為7.22個/張；而葉面接觸培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率只有73.91%，平均不定芽數(shù)為4.76個/張。方差分析結(jié)果表明，2種接種方式不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)的差異均達(dá)到極顯著水平，因此煙葉唇柱苣苔葉片不定芽的誘導(dǎo)以葉背平置于培養(yǎng)基上為宜。

2.2pH值對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表2可知，pH值為6.0的培養(yǎng)基上不定芽的誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)最高，分別為100%和7.34個/張；其次為pH值為6.5的培養(yǎng)基，其不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)分別為96.30%和6.07個/張；最低的為pH值為5.0的培養(yǎng)基，其不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)分別為79.17%和4.01個/張。經(jīng)方差分析可知，pH值為6.0的培養(yǎng)基與其他培養(yǎng)基處理的不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)的差異極顯著，因此煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值在滅菌前宜調(diào)至6.0。

2.3無機(jī)鹽濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響

從表3可見，除1/4MS外，其余3種無機(jī)鹽濃度對葉片不定芽的誘導(dǎo)率均能達(dá)到100%，而平均不定芽數(shù)則隨著無機(jī)鹽濃度的增加而增加，呈正相關(guān)關(guān)系。MS對葉片不定芽的誘導(dǎo)效果最好，平均不定芽數(shù)最多，達(dá)7.23個/張，與其他處理差異極顯著，且芽苗生長健壯，葉色濃綠；3/4MS的誘導(dǎo)效果次之，分化芽數(shù)為6.18個/張，芽生長勢也好，葉綠色；1/2MS和1/4MS誘導(dǎo)的平均不定芽數(shù)差異不顯著，但1/4MS誘導(dǎo)的不定芽生長勢差，部分葉片出現(xiàn)黃化現(xiàn)象。說明全量MS培養(yǎng)基適合煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2.4不同種類細(xì)胞分裂素對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表4知，6-BA和TDZ對葉片不定芽的誘導(dǎo)率均達(dá)到100%，但二者誘導(dǎo)的平均不定芽數(shù)差異極顯著，6-BA平均不定芽數(shù)達(dá)7.17個/張，而TDZ僅為4.25個/張；誘導(dǎo)效果最差的為KT，不定芽誘導(dǎo)率僅為47.62%，平均不定芽數(shù)為3.10個/張。從生長勢看，6-BA誘導(dǎo)的不定芽長勢好，KT誘導(dǎo)的不定芽也正常，但較細(xì)小，而TDZ誘導(dǎo)的芽在40d以后出現(xiàn)較多的玻璃化現(xiàn)象。因此，煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞分裂素宜選用6-BA。

2.5蔗糖濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表5可以看出，30g/L蔗糖對煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)效果最好，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到100%，平均不定芽數(shù)為7.50個/張；其次是20g/L蔗糖，不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)分別為100%和6.67個/張；最差的為50g/L蔗糖，不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)分別為92.31%和3.14個/張。可見5種蔗糖濃度培養(yǎng)基的不定芽生長均正常。經(jīng)方差分析結(jié)果可知，20、30g/L蔗糖誘導(dǎo)的不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)差異均不顯著，而二者與10、40、50g/L蔗糖處理差異極顯著，說明蔗糖濃度對煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)影響較大，過高或過低的蔗糖均不利于不定芽的生長，因此煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)可以選用20～30g/L蔗糖。

2.6不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導(dǎo)的影響

葉片接種于6個含植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，25d后均有不定芽分化，40d平均不定芽數(shù)均超過4個/張。從表6可見，不同的6-BA和NAA配比對煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)和生長影響很大，其中以6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L組合對不定芽的誘導(dǎo)效果最好，不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)100%，不定芽分化數(shù)量最多，平均有9.58個/張，其芽苗生長勢好，葉色綠而健壯（圖2）。其次為6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L組合，其不定芽誘導(dǎo)率也高達(dá)100%，但不定芽分化數(shù)量較少，為7.21個/張。方差分析結(jié)果表明，6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L組合與6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L組合不定芽誘導(dǎo)率差異不顯著，與其他配比組合差異極顯著；而平均不定芽數(shù)與其他配比差異極顯著，因此適合煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，影響煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的因素較多，接種葉片放置方式、培養(yǎng)基pH值、無機(jī)鹽濃度、蔗糖濃度、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及配比對不定芽誘導(dǎo)均有影響，本試驗(yàn)中所有處理均可誘導(dǎo)不定芽分化，但各處理間差異較大。

煙葉唇柱苣苔以葉背朝下的方式接入培養(yǎng)基為佳，表現(xiàn)為誘導(dǎo)率高，分化芽數(shù)多，與葉面朝下方式間差異極顯著。桂林唇柱苣苔、三苞唇柱苣苔等苦苣苔科植物組織培養(yǎng)的葉片外植體均為葉背朝下接入培養(yǎng)基中[5-6]，不同植物外植體的生長與分化所需最適合的pH值不同，煙葉唇柱苣苔的葉片分化以pH值為6.0最適宜，與其他處理間的不定芽誘導(dǎo)率和不定芽分化數(shù)差異極顯著。本試驗(yàn)中無機(jī)鹽濃度對不定芽的誘導(dǎo)數(shù)量和生長勢影響極大，在全量的MS培養(yǎng)基上平均不定芽數(shù)最多，生長勢好；而在1/4MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最差，不定芽誘導(dǎo)數(shù)量少，葉片黃化。培養(yǎng)基中的無機(jī)營養(yǎng)成分是組成植物生命體的主要元素，會影響植物的生長與分化，而鎂是葉綠素分子結(jié)構(gòu)中的一部分，缺鎂時葉綠素不能形成，致使葉片失綠[7]，這可能是培養(yǎng)物出現(xiàn)黃化現(xiàn)象的原因。植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及配比對不定芽的誘導(dǎo)影響極大，6-BA的效果極顯著優(yōu)于KT和TDZ。TDZ兼有細(xì)胞分裂素和生長素的功效，在組培中應(yīng)用廣泛[8]，但在苦苣苔科植物中尚未有應(yīng)用的報(bào)道。本試驗(yàn)中TDZ的效果并不理想，誘導(dǎo)率低分化芽數(shù)少，后期還會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，這也許是由于濃度偏高的原因。6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L組合對不定芽的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)到100%，平均誘導(dǎo)不定芽數(shù)高達(dá)9.58個/張，較其他配比差異極顯著。該結(jié)果與湯正輝的研究結(jié)果[9]有差異，湯正輝認(rèn)為6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L組合的效果最佳[9]。蔗糖在組織培養(yǎng)中主要作為碳源和能源物質(zhì)，同時可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓[7]，其濃度與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)[10-11]。本試驗(yàn)中蔗糖對煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)生長的作用十分明顯，過高或過低的蔗糖濃度均不利于芽的誘導(dǎo)，以30g/L濃度最佳。

綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，在溫度（26±2）℃、光照度1500lx的培養(yǎng)條件下，煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L，滅菌前pH值為6.0，接種葉片以葉背平置于培養(yǎng)基上，不定芽誘導(dǎo)效果最好，其誘導(dǎo)率高，不定芽分化多，芽苗生長勢好。

苦苣苔科植物由于葉片表面密布絨毛，消毒極為困難，初代培養(yǎng)污染率極高。目前，有關(guān)煙葉唇柱苣苔的組織培養(yǎng)研究極少，本試驗(yàn)通過系統(tǒng)研究建立起葉片誘導(dǎo)體系，減少了初代培養(yǎng)接種污染概率，且增殖效率高，可以快速建立高效再生體系，為煙葉唇柱苣苔的商品化開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也可以為其他苦苣苔植物的開發(fā)利用及技術(shù)研究提供技術(shù)參考。

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2.4不同種類細(xì)胞分裂素對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表4知，6-BA和TDZ對葉片不定芽的誘導(dǎo)率均達(dá)到100%，但二者誘導(dǎo)的平均不定芽數(shù)差異極顯著，6-BA平均不定芽數(shù)達(dá)7.17個/張，而TDZ僅為4.25個/張；誘導(dǎo)效果最差的為KT，不定芽誘導(dǎo)率僅為47.62%，平均不定芽數(shù)為3.10個/張。從生長勢看，6-BA誘導(dǎo)的不定芽長勢好，KT誘導(dǎo)的不定芽也正常，但較細(xì)小，而TDZ誘導(dǎo)的芽在40d以后出現(xiàn)較多的玻璃化現(xiàn)象。因此，煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞分裂素宜選用6-BA。

2.5蔗糖濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表5可以看出，30g/L蔗糖對煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)效果最好，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到100%，平均不定芽數(shù)為7.50個/張；其次是20g/L蔗糖，不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)分別為100%和6.67個/張；最差的為50g/L蔗糖，不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)分別為92.31%和3.14個/張。可見5種蔗糖濃度培養(yǎng)基的不定芽生長均正常。經(jīng)方差分析結(jié)果可知，20、30g/L蔗糖誘導(dǎo)的不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)差異均不顯著，而二者與10、40、50g/L蔗糖處理差異極顯著，說明蔗糖濃度對煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)影響較大，過高或過低的蔗糖均不利于不定芽的生長，因此煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)可以選用20～30g/L蔗糖。

2.6不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導(dǎo)的影響

葉片接種于6個含植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，25d后均有不定芽分化，40d平均不定芽數(shù)均超過4個/張。從表6可見，不同的6-BA和NAA配比對煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)和生長影響很大，其中以6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L組合對不定芽的誘導(dǎo)效果最好，不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)100%，不定芽分化數(shù)量最多，平均有9.58個/張，其芽苗生長勢好，葉色綠而健壯（圖2）。其次為6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L組合，其不定芽誘導(dǎo)率也高達(dá)100%，但不定芽分化數(shù)量較少，為7.21個/張。方差分析結(jié)果表明，6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L組合與6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L組合不定芽誘導(dǎo)率差異不顯著，與其他配比組合差異極顯著；而平均不定芽數(shù)與其他配比差異極顯著，因此適合煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，影響煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的因素較多，接種葉片放置方式、培養(yǎng)基pH值、無機(jī)鹽濃度、蔗糖濃度、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及配比對不定芽誘導(dǎo)均有影響，本試驗(yàn)中所有處理均可誘導(dǎo)不定芽分化，但各處理間差異較大。

煙葉唇柱苣苔以葉背朝下的方式接入培養(yǎng)基為佳，表現(xiàn)為誘導(dǎo)率高，分化芽數(shù)多，與葉面朝下方式間差異極顯著。桂林唇柱苣苔、三苞唇柱苣苔等苦苣苔科植物組織培養(yǎng)的葉片外植體均為葉背朝下接入培養(yǎng)基中[5-6]，不同植物外植體的生長與分化所需最適合的pH值不同，煙葉唇柱苣苔的葉片分化以pH值為6.0最適宜，與其他處理間的不定芽誘導(dǎo)率和不定芽分化數(shù)差異極顯著。本試驗(yàn)中無機(jī)鹽濃度對不定芽的誘導(dǎo)數(shù)量和生長勢影響極大，在全量的MS培養(yǎng)基上平均不定芽數(shù)最多，生長勢好；而在1/4MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最差，不定芽誘導(dǎo)數(shù)量少，葉片黃化。培養(yǎng)基中的無機(jī)營養(yǎng)成分是組成植物生命體的主要元素，會影響植物的生長與分化，而鎂是葉綠素分子結(jié)構(gòu)中的一部分，缺鎂時葉綠素不能形成，致使葉片失綠[7]，這可能是培養(yǎng)物出現(xiàn)黃化現(xiàn)象的原因。植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及配比對不定芽的誘導(dǎo)影響極大，6-BA的效果極顯著優(yōu)于KT和TDZ。TDZ兼有細(xì)胞分裂素和生長素的功效，在組培中應(yīng)用廣泛[8]，但在苦苣苔科植物中尚未有應(yīng)用的報(bào)道。本試驗(yàn)中TDZ的效果并不理想，誘導(dǎo)率低分化芽數(shù)少，后期還會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，這也許是由于濃度偏高的原因。6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L組合對不定芽的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)到100%，平均誘導(dǎo)不定芽數(shù)高達(dá)9.58個/張，較其他配比差異極顯著。該結(jié)果與湯正輝的研究結(jié)果[9]有差異，湯正輝認(rèn)為6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L組合的效果最佳[9]。蔗糖在組織培養(yǎng)中主要作為碳源和能源物質(zhì)，同時可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓[7]，其濃度與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)[10-11]。本試驗(yàn)中蔗糖對煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)生長的作用十分明顯，過高或過低的蔗糖濃度均不利于芽的誘導(dǎo)，以30g/L濃度最佳。

綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，在溫度（26±2）℃、光照度1500lx的培養(yǎng)條件下，煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L，滅菌前pH值為6.0，接種葉片以葉背平置于培養(yǎng)基上，不定芽誘導(dǎo)效果最好，其誘導(dǎo)率高，不定芽分化多，芽苗生長勢好。

苦苣苔科植物由于葉片表面密布絨毛，消毒極為困難，初代培養(yǎng)污染率極高。目前，有關(guān)煙葉唇柱苣苔的組織培養(yǎng)研究極少，本試驗(yàn)通過系統(tǒng)研究建立起葉片誘導(dǎo)體系，減少了初代培養(yǎng)接種污染概率，且增殖效率高，可以快速建立高效再生體系，為煙葉唇柱苣苔的商品化開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也可以為其他苦苣苔植物的開發(fā)利用及技術(shù)研究提供技術(shù)參考。

參考文獻(xiàn)：

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2.4不同種類細(xì)胞分裂素對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表4知，6-BA和TDZ對葉片不定芽的誘導(dǎo)率均達(dá)到100%，但二者誘導(dǎo)的平均不定芽數(shù)差異極顯著，6-BA平均不定芽數(shù)達(dá)7.17個/張，而TDZ僅為4.25個/張；誘導(dǎo)效果最差的為KT，不定芽誘導(dǎo)率僅為47.62%，平均不定芽數(shù)為3.10個/張。從生長勢看，6-BA誘導(dǎo)的不定芽長勢好，KT誘導(dǎo)的不定芽也正常，但較細(xì)小，而TDZ誘導(dǎo)的芽在40d以后出現(xiàn)較多的玻璃化現(xiàn)象。因此，煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)，細(xì)胞分裂素宜選用6-BA。

2.5蔗糖濃度對不定芽誘導(dǎo)的影響

由表5可以看出，30g/L蔗糖對煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)效果最好，不定芽誘導(dǎo)率達(dá)到100%，平均不定芽數(shù)為7.50個/張；其次是20g/L蔗糖，不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)分別為100%和6.67個/張；最差的為50g/L蔗糖，不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)分別為92.31%和3.14個/張?？梢?種蔗糖濃度培養(yǎng)基的不定芽生長均正常。經(jīng)方差分析結(jié)果可知，20、30g/L蔗糖誘導(dǎo)的不定芽誘導(dǎo)率和平均不定芽數(shù)差異均不顯著，而二者與10、40、50g/L蔗糖處理差異極顯著，說明蔗糖濃度對煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)影響較大，過高或過低的蔗糖均不利于不定芽的生長，因此煙葉唇柱苣苔不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)可以選用20～30g/L蔗糖。

2.6不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對不定芽誘導(dǎo)的影響

葉片接種于6個含植物生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基中，25d后均有不定芽分化，40d平均不定芽數(shù)均超過4個/張。從表6可見，不同的6-BA和NAA配比對煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)和生長影響很大，其中以6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L組合對不定芽的誘導(dǎo)效果最好，不定芽誘導(dǎo)率高達(dá)100%，不定芽分化數(shù)量最多，平均有9.58個/張，其芽苗生長勢好，葉色綠而健壯（圖2）。其次為6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L組合，其不定芽誘導(dǎo)率也高達(dá)100%，但不定芽分化數(shù)量較少，為7.21個/張。方差分析結(jié)果表明，6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L組合與6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L組合不定芽誘導(dǎo)率差異不顯著，與其他配比組合差異極顯著；而平均不定芽數(shù)與其他配比差異極顯著，因此適合煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的植物生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，影響煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的因素較多，接種葉片放置方式、培養(yǎng)基pH值、無機(jī)鹽濃度、蔗糖濃度、植物生長調(diào)節(jié)劑種類及配比對不定芽誘導(dǎo)均有影響，本試驗(yàn)中所有處理均可誘導(dǎo)不定芽分化，但各處理間差異較大。

煙葉唇柱苣苔以葉背朝下的方式接入培養(yǎng)基為佳，表現(xiàn)為誘導(dǎo)率高，分化芽數(shù)多，與葉面朝下方式間差異極顯著。桂林唇柱苣苔、三苞唇柱苣苔等苦苣苔科植物組織培養(yǎng)的葉片外植體均為葉背朝下接入培養(yǎng)基中[5-6]，不同植物外植體的生長與分化所需最適合的pH值不同，煙葉唇柱苣苔的葉片分化以pH值為6.0最適宜，與其他處理間的不定芽誘導(dǎo)率和不定芽分化數(shù)差異極顯著。本試驗(yàn)中無機(jī)鹽濃度對不定芽的誘導(dǎo)數(shù)量和生長勢影響極大，在全量的MS培養(yǎng)基上平均不定芽數(shù)最多，生長勢好；而在1/4MS培養(yǎng)基的誘導(dǎo)效果最差，不定芽誘導(dǎo)數(shù)量少，葉片黃化。培養(yǎng)基中的無機(jī)營養(yǎng)成分是組成植物生命體的主要元素，會影響植物的生長與分化，而鎂是葉綠素分子結(jié)構(gòu)中的一部分，缺鎂時葉綠素不能形成，致使葉片失綠[7]，這可能是培養(yǎng)物出現(xiàn)黃化現(xiàn)象的原因。植物生長調(diào)節(jié)劑的種類及配比對不定芽的誘導(dǎo)影響極大，6-BA的效果極顯著優(yōu)于KT和TDZ。TDZ兼有細(xì)胞分裂素和生長素的功效，在組培中應(yīng)用廣泛[8]，但在苦苣苔科植物中尚未有應(yīng)用的報(bào)道。本試驗(yàn)中TDZ的效果并不理想，誘導(dǎo)率低分化芽數(shù)少，后期還會出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，這也許是由于濃度偏高的原因。6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L組合對不定芽的誘導(dǎo)效果最好，誘導(dǎo)率達(dá)到100%，平均誘導(dǎo)不定芽數(shù)高達(dá)9.58個/張，較其他配比差異極顯著。該結(jié)果與湯正輝的研究結(jié)果[9]有差異，湯正輝認(rèn)為6-BA0.1mg/L+NAA0.1mg/L組合的效果最佳[9]。蔗糖在組織培養(yǎng)中主要作為碳源和能源物質(zhì)，同時可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓[7]，其濃度與細(xì)胞增殖和分化有關(guān)[10-11]。本試驗(yàn)中蔗糖對煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)生長的作用十分明顯，過高或過低的蔗糖濃度均不利于芽的誘導(dǎo)，以30g/L濃度最佳。

綜合試驗(yàn)結(jié)果可知，在溫度（26±2）℃、光照度1500lx的培養(yǎng)條件下，煙葉唇柱苣苔不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L，滅菌前pH值為6.0，接種葉片以葉背平置于培養(yǎng)基上，不定芽誘導(dǎo)效果最好，其誘導(dǎo)率高，不定芽分化多，芽苗生長勢好。

苦苣苔科植物由于葉片表面密布絨毛，消毒極為困難，初代培養(yǎng)污染率極高。目前，有關(guān)煙葉唇柱苣苔的組織培養(yǎng)研究極少，本試驗(yàn)通過系統(tǒng)研究建立起葉片誘導(dǎo)體系，減少了初代培養(yǎng)接種污染概率，且增殖效率高，可以快速建立高效再生體系，為煙葉唇柱苣苔的商品化開發(fā)奠定基礎(chǔ)，也可以為其他苦苣苔植物的開發(fā)利用及技術(shù)研究提供技術(shù)參考。

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