農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化影響因子和植株再生條件

張瑩瑩+吳連成+張賽賽+安允權(quán)+崔新建+陳彥惠

摘要：以HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的幼胚誘導(dǎo)的胚性愈傷為轉(zhuǎn)化受體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法，將抗粗縮病RNA干擾基因?qū)胗衩子鷤M織，并對(duì)影響轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行研究，以優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明：繼代3次的4種玉米材料的抗性愈傷率最高，且不同品種間存在差異，HiⅡ的抗性愈傷率最高，為31.25%，其次為HiⅡB（26.56%）、HiⅡA（24.45%），H99的抗性愈傷率最低，僅為10.26%；預(yù)培養(yǎng)6d的愈傷組織適于轉(zhuǎn)化，其中HiⅡ的抗性愈傷率最高，為27.70%；結(jié)果還表明，菌液濃度D600nm=0.5～0.6是最佳的轉(zhuǎn)化條件。通過(guò)優(yōu)化后的條件對(duì)得到的抗性愈傷用除草劑進(jìn)行篩選，HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99材料分別得到10、5、4、3塊抗性愈傷組織；標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因，通過(guò)PCR檢測(cè)分別得到5、2、2、1塊陽(yáng)性愈傷組織，再進(jìn)一步用bar基因試紙條檢測(cè)，分別得到4、1、2、1株陽(yáng)性植株。

關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌介導(dǎo)法；遺傳轉(zhuǎn)化；植株再生；抗性愈傷；bar基因

中圖分類(lèi)號(hào)：Q943.2；S513.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-1302（2014）11-0051-03

近年來(lái)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域獲得了極大的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以將外源基因整合到基因組中，從而改良農(nóng)作物的性狀。玉米是世界第三大糧食作物，廣泛應(yīng)用于食品、化學(xué)、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域，它的遺傳轉(zhuǎn)化研究一直備受關(guān)注。

目前玉米轉(zhuǎn)化的方法主要有基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法?；驑尫ɑㄙM(fèi)成本比較大，轉(zhuǎn)入的片段拷貝數(shù)多；而農(nóng)桿菌介導(dǎo)法方法比較簡(jiǎn)單，且成本少、轉(zhuǎn)化效率比較高、插入片段的拷貝數(shù)比較少，同時(shí)遺傳比較穩(wěn)定，因而被廣泛采用。自1988年Rhodes等第1次獲得完整的玉米轉(zhuǎn)基因植株[1]以來(lái)，玉米的遺傳轉(zhuǎn)化體系取得了很大的進(jìn)步和發(fā)展，目前國(guó)外許多轉(zhuǎn)基因品種已經(jīng)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，轉(zhuǎn)化方法也越來(lái)越成熟。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)得到了重大的突破，黃璐等采用農(nóng)桿菌侵染玉米單交種胚性愈傷組織成功，同時(shí)獲得再生植株[2-3]；王國(guó)英等通過(guò)侵染玉米幼胚并將其誘導(dǎo)成愈傷，成功將Bt基因?qū)胗衩字衃4]。

本研究利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，用抗粗縮病的RNA干擾基因轉(zhuǎn)化由HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料誘導(dǎo)出的胚性愈傷組織，以轉(zhuǎn)移粗縮病RNA干擾基因，結(jié)果得到了抗性愈傷組織并再生成苗。此外，試驗(yàn)對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的部分因素進(jìn)行了初步研究，優(yōu)化了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化玉米的條件，提高了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的轉(zhuǎn)化效率，為今后培育抗病新品種打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

玉米材料HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99中由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)賴錦盛教授贈(zèng)送，于2013年4月下旬至5月中旬分期播種于河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)。載體為RNA干擾抗玉米粗縮病載體。

1.2試驗(yàn)方法

取HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料授粉10d左右、大小為1～2mm的未成熟幼胚，盾片向上放置于基本培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)，每2周繼代1次，約45d后形成穩(wěn)定的愈傷組織。分別用繼代3、4、5、6、7次的4種基因型玉米的愈傷組織進(jìn)行侵染轉(zhuǎn)化，侵染后的愈傷組織經(jīng)選擇培養(yǎng)基篩選2次，最后獲得抗性愈傷組織，計(jì)算抗性愈傷率。分別選取繼代3次，預(yù)培養(yǎng)2、5、6、8、10d的4種玉米材料愈傷進(jìn)行侵染，通過(guò)3次抗性篩選后，計(jì)算抗性愈傷率。將預(yù)培養(yǎng)5d的愈傷組織分別用D600nm值為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的菌液浸泡10min，通過(guò)3次抗性篩選后，計(jì)算抗性愈傷率。

1.3數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0和Excel2013軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同繼代次數(shù)對(duì)4種玉米材料抗性愈傷率的影響

分別將繼代3、4、5、6、7次的HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米幼胚誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織用D600nm=0.5的農(nóng)桿菌侵染，根據(jù)產(chǎn)生的抗性愈傷數(shù)作統(tǒng)計(jì)分析，詳見(jiàn)表1。

由表1看出，繼代3次的HiⅡ玉米對(duì)農(nóng)桿菌最敏感，抗性愈傷組織率為31.25%；其次是HiⅡB，為26.56%；HiⅡA為24.45%，H99為10.26%。繼代7次的抗性愈傷率均低于繼代3、4、5、6次，其中H99的抗性愈傷率最低，僅為5.13%。

本試驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著繼代次數(shù)的增加，愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率逐漸降低，繼代3次是農(nóng)桿菌侵染的最佳時(shí)期。

2.2預(yù)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抗性愈傷轉(zhuǎn)化率的影響

分別選取繼代3次，預(yù)培養(yǎng)2、5、6、8、10d的愈傷進(jìn)行侵染，通過(guò)3次抗性篩選后，其抗性愈傷率見(jiàn)表2。

由表2可以看出，侵染前愈傷組織的培養(yǎng)狀態(tài)對(duì)玉米轉(zhuǎn)化效率有很大的影響。HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99這4種玉米材料都以繼代6d的抗性愈傷率最高，而繼代2d的抗性愈傷率最低。HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99這4種玉米材料在新鮮繼代培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2d的抗性愈傷率分別為9.00%、10.00%、9.55%、4.29%；預(yù)培養(yǎng)2～6d，抗性愈傷率呈直線上升趨勢(shì)，6d時(shí)達(dá)到最高值，4種材料以HiⅡ繼代6d時(shí)的愈傷組織轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到了27.70%，同期的HiⅡB、HiⅡA、H99分別為22.73%、21.43%、9.30%；6～10d時(shí)的抗性愈傷率有所降低，10d時(shí)最低，HiⅡ?yàn)?5.94%，HiⅡB為12.38%，HiⅡA為11.91%，H99僅為4.76%。

2.3農(nóng)桿菌濃度對(duì)抗性愈傷轉(zhuǎn)化率的影響

用D600nm值分別為0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8的菌液侵染HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料的愈傷組織10min，圖1結(jié)果顯示，農(nóng)桿菌濃度在0.3～0.6之間時(shí)，轉(zhuǎn)化率隨著農(nóng)桿菌濃度升高而增高，HiⅡ的轉(zhuǎn)化率從9.00%升高到33.33%，HiⅡB的轉(zhuǎn)化率從10.21%升高到23.62%，HiⅡA的轉(zhuǎn)化率從8.11%升高到20.31%，H99的轉(zhuǎn)化率從2.06%升高到7.35%；當(dāng)農(nóng)桿菌濃度大于0.6時(shí)，增加農(nóng)桿菌的濃度，轉(zhuǎn)化率反而下降，發(fā)生這樣的結(jié)果可能是因?yàn)檗r(nóng)桿菌濃度大時(shí)造成愈傷組織污染，使轉(zhuǎn)化效率降低。綜合比較可以看出，D600nm值為0.5～0.6是合適的濃度范圍。

2.4抗性愈傷組織標(biāo)記基因bar的PCR檢測(cè)

在優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因體系中加入除草劑進(jìn)行篩選，得到22塊抗性愈傷組織，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分別得到10、5、4、3塊抗性愈傷組織，再通過(guò)標(biāo)記基因bar的PCR檢測(cè)分別得到5、2、2、1塊陽(yáng)性愈傷組織，標(biāo)記基因大小為600bp，陽(yáng)性率分別為50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（圖2）。綜合比較可知，HiⅡ的陽(yáng)性率相對(duì)較高。

2.5抗性愈傷再生植株的獲得及bar基因試紙條檢測(cè)

將PCR檢測(cè)得到的陽(yáng)性愈傷進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)繁，一部分進(jìn)行出苗試驗(yàn)，另一部分進(jìn)行保留，保留的目的是怕陽(yáng)性愈傷在出苗過(guò)程中死亡。對(duì)于出苗的植株進(jìn)行bar基因試紙條檢測(cè)，目的是從蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步檢測(cè)目的基因是否已經(jīng)導(dǎo)入玉米基因組，結(jié)果從HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分別獲得4、1、2、1株陽(yáng)性植株，其中HiⅡ的轉(zhuǎn)基因效果最好（圖3）。

2.6T0代轉(zhuǎn)化植株目的基因的PCR鑒定

對(duì)PCR檢測(cè)獲得的10株轉(zhuǎn)基因植株設(shè)計(jì)目的基因特異引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出400bp的目的條帶，檢測(cè)到10株全為陽(yáng)性植株（圖4）。結(jié)果表明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中。

3討論

對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化，國(guó)內(nèi)外報(bào)道大多數(shù)都是以幼胚作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體[5]，但是幼胚的取材受時(shí)間影響很大，一旦錯(cuò)過(guò)了最佳時(shí)期就很難使試驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行。而愈傷組織不受時(shí)間影響，可以長(zhǎng)期作為轉(zhuǎn)化的受體，而且能長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)。

玉米材料的不同對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化有很大的影響，有的材料能誘導(dǎo)出適合轉(zhuǎn)化的玉米材料，有的則不能。本試驗(yàn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化繼代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈傷組織，結(jié)果表明：HiⅡ的抗性愈傷率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，這與George等的研究結(jié)果[6-7]一致，即不同的玉米品種接受農(nóng)桿菌侵染的能力也不同，接受轉(zhuǎn)化的受體對(duì)品種的依賴性很強(qiáng)；基因型相同時(shí)，繼代3次的抗性愈傷率高于其他繼代次數(shù)，與余桂榮的試驗(yàn)結(jié)果相同；侵染前預(yù)培養(yǎng)愈傷組織的轉(zhuǎn)化頻率高于未預(yù)培養(yǎng)的，且預(yù)培養(yǎng)6d的侵染效果較好，這與伍曉麗等的研究結(jié)果[8]相一致。產(chǎn)生這些結(jié)果的原因可能有以下幾點(diǎn)：（1）基因型方面，B73和A188是良好的轉(zhuǎn)基因受體材料，HiⅡB和HiⅡA是B73與A188雜交得到的衍生系，HiⅡB誘導(dǎo)的愈傷組織較HiⅡA松散，HiⅡA外殼相對(duì)比較硬，HiⅡ是由HiⅡB與HiⅡA雜交所得到的，具有兩者的綜合優(yōu)點(diǎn)，為Ⅱ型愈傷組織，Ⅱ型愈傷的生長(zhǎng)速度非常快，形狀類(lèi)似菜花，結(jié)構(gòu)松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈傷組織大多為I型，外殼比較硬，不太容易擴(kuò)大培養(yǎng)，抗性愈傷率比較低。（2）在愈傷組織的整個(gè)生長(zhǎng)期間，前3次的生長(zhǎng)比較快，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，3次以后由于代謝物質(zhì)的逐漸積累，篩選出的抗性愈傷較低，因而繼代3次的玉米愈傷組織侵染效率比較高。（3）侵染前預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間有利于愈傷的生理狀態(tài)達(dá)到良好的狀態(tài)，沒(méi)有預(yù)培養(yǎng)的愈傷在上次繼代到14d時(shí)，有可能會(huì)有少量的有毒物質(zhì)產(chǎn)生，而預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間的愈傷組織代謝比較旺盛，適于農(nóng)桿菌侵染。

農(nóng)桿菌濃度對(duì)侵染效率也有很大的影響。農(nóng)桿菌濃度過(guò)低時(shí)，吸附在細(xì)胞表面的農(nóng)桿菌過(guò)少而不能有效地將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，濃度過(guò)大時(shí)容易使愈傷組織污染。本研究表明，當(dāng)菌液濃度為D600nm=0.5～0.6時(shí)，HiⅡ愈傷組織的抗性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最高值。

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因體系對(duì)4種玉米材料的愈傷組織進(jìn)行侵染，在篩選過(guò)程中選擇出抗性愈傷組織，取其抗性愈傷的一部分提取DNA，并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)出來(lái)的抗性愈傷一分為二，一部分進(jìn)行擴(kuò)繁，另一部分進(jìn)行再生出苗，再生出苗的植株進(jìn)行bar基因試紙條的檢測(cè)，進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平上對(duì)轉(zhuǎn)基因結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因體系極大地提高了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化率。

參考文獻(xiàn)：

[1]RhodesCA，PierceDA，MettlerIJ，etal.Geneticallytransformedmaizeplantsfromprotoplasts[J].Science，1988，240（4849）：204-207.

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[3]張榮，王國(guó)英，張曉紅，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9（1）：45-48.

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[8]伍曉麗，朱禎，李晚忱，等.農(nóng)桿菌介導(dǎo)豇豆胰蛋白酶抑制劑基因（cpti）在玉米中的遺傳轉(zhuǎn)化[J].作物學(xué)報(bào)，2004（3）：297-298.

[9]季良越，孫曉麗，韋小敏，等.玉米胚性愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生研究[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，36（2）：101-105.

2.4抗性愈傷組織標(biāo)記基因bar的PCR檢測(cè)

在優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因體系中加入除草劑進(jìn)行篩選，得到22塊抗性愈傷組織，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分別得到10、5、4、3塊抗性愈傷組織，再通過(guò)標(biāo)記基因bar的PCR檢測(cè)分別得到5、2、2、1塊陽(yáng)性愈傷組織，標(biāo)記基因大小為600bp，陽(yáng)性率分別為50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（圖2）。綜合比較可知，HiⅡ的陽(yáng)性率相對(duì)較高。

2.5抗性愈傷再生植株的獲得及bar基因試紙條檢測(cè)

將PCR檢測(cè)得到的陽(yáng)性愈傷進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)繁，一部分進(jìn)行出苗試驗(yàn)，另一部分進(jìn)行保留，保留的目的是怕陽(yáng)性愈傷在出苗過(guò)程中死亡。對(duì)于出苗的植株進(jìn)行bar基因試紙條檢測(cè)，目的是從蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步檢測(cè)目的基因是否已經(jīng)導(dǎo)入玉米基因組，結(jié)果從HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分別獲得4、1、2、1株陽(yáng)性植株，其中HiⅡ的轉(zhuǎn)基因效果最好（圖3）。

2.6T0代轉(zhuǎn)化植株目的基因的PCR鑒定

對(duì)PCR檢測(cè)獲得的10株轉(zhuǎn)基因植株設(shè)計(jì)目的基因特異引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出400bp的目的條帶，檢測(cè)到10株全為陽(yáng)性植株（圖4）。結(jié)果表明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中。

3討論

對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化，國(guó)內(nèi)外報(bào)道大多數(shù)都是以幼胚作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體[5]，但是幼胚的取材受時(shí)間影響很大，一旦錯(cuò)過(guò)了最佳時(shí)期就很難使試驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行。而愈傷組織不受時(shí)間影響，可以長(zhǎng)期作為轉(zhuǎn)化的受體，而且能長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)。

玉米材料的不同對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化有很大的影響，有的材料能誘導(dǎo)出適合轉(zhuǎn)化的玉米材料，有的則不能。本試驗(yàn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化繼代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈傷組織，結(jié)果表明：HiⅡ的抗性愈傷率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，這與George等的研究結(jié)果[6-7]一致，即不同的玉米品種接受農(nóng)桿菌侵染的能力也不同，接受轉(zhuǎn)化的受體對(duì)品種的依賴性很強(qiáng)；基因型相同時(shí)，繼代3次的抗性愈傷率高于其他繼代次數(shù)，與余桂榮的試驗(yàn)結(jié)果相同；侵染前預(yù)培養(yǎng)愈傷組織的轉(zhuǎn)化頻率高于未預(yù)培養(yǎng)的，且預(yù)培養(yǎng)6d的侵染效果較好，這與伍曉麗等的研究結(jié)果[8]相一致。產(chǎn)生這些結(jié)果的原因可能有以下幾點(diǎn)：（1）基因型方面，B73和A188是良好的轉(zhuǎn)基因受體材料，HiⅡB和HiⅡA是B73與A188雜交得到的衍生系，HiⅡB誘導(dǎo)的愈傷組織較HiⅡA松散，HiⅡA外殼相對(duì)比較硬，HiⅡ是由HiⅡB與HiⅡA雜交所得到的，具有兩者的綜合優(yōu)點(diǎn)，為Ⅱ型愈傷組織，Ⅱ型愈傷的生長(zhǎng)速度非?？欤螤铑?lèi)似菜花，結(jié)構(gòu)松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈傷組織大多為I型，外殼比較硬，不太容易擴(kuò)大培養(yǎng)，抗性愈傷率比較低。（2）在愈傷組織的整個(gè)生長(zhǎng)期間，前3次的生長(zhǎng)比較快，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，3次以后由于代謝物質(zhì)的逐漸積累，篩選出的抗性愈傷較低，因而繼代3次的玉米愈傷組織侵染效率比較高。（3）侵染前預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間有利于愈傷的生理狀態(tài)達(dá)到良好的狀態(tài)，沒(méi)有預(yù)培養(yǎng)的愈傷在上次繼代到14d時(shí)，有可能會(huì)有少量的有毒物質(zhì)產(chǎn)生，而預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間的愈傷組織代謝比較旺盛，適于農(nóng)桿菌侵染。

農(nóng)桿菌濃度對(duì)侵染效率也有很大的影響。農(nóng)桿菌濃度過(guò)低時(shí)，吸附在細(xì)胞表面的農(nóng)桿菌過(guò)少而不能有效地將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，濃度過(guò)大時(shí)容易使愈傷組織污染。本研究表明，當(dāng)菌液濃度為D600nm=0.5～0.6時(shí)，HiⅡ愈傷組織的抗性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最高值。

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因體系對(duì)4種玉米材料的愈傷組織進(jìn)行侵染，在篩選過(guò)程中選擇出抗性愈傷組織，取其抗性愈傷的一部分提取DNA，并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)出來(lái)的抗性愈傷一分為二，一部分進(jìn)行擴(kuò)繁，另一部分進(jìn)行再生出苗，再生出苗的植株進(jìn)行bar基因試紙條的檢測(cè)，進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平上對(duì)轉(zhuǎn)基因結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因體系極大地提高了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化率。

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2.4抗性愈傷組織標(biāo)記基因bar的PCR檢測(cè)

在優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因體系中加入除草劑進(jìn)行篩選，得到22塊抗性愈傷組織，其中HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料分別得到10、5、4、3塊抗性愈傷組織，再通過(guò)標(biāo)記基因bar的PCR檢測(cè)分別得到5、2、2、1塊陽(yáng)性愈傷組織，標(biāo)記基因大小為600bp，陽(yáng)性率分別為50.00%、40.00%、50.00%，33.33%（圖2）。綜合比較可知，HiⅡ的陽(yáng)性率相對(duì)較高。

2.5抗性愈傷再生植株的獲得及bar基因試紙條檢測(cè)

將PCR檢測(cè)得到的陽(yáng)性愈傷進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)繁，一部分進(jìn)行出苗試驗(yàn)，另一部分進(jìn)行保留，保留的目的是怕陽(yáng)性愈傷在出苗過(guò)程中死亡。對(duì)于出苗的植株進(jìn)行bar基因試紙條檢測(cè)，目的是從蛋白質(zhì)水平上進(jìn)一步檢測(cè)目的基因是否已經(jīng)導(dǎo)入玉米基因組，結(jié)果從HiⅡ、HiⅡB、HiⅡA、H99玉米材料中分別獲得4、1、2、1株陽(yáng)性植株，其中HiⅡ的轉(zhuǎn)基因效果最好（圖3）。

2.6T0代轉(zhuǎn)化植株目的基因的PCR鑒定

對(duì)PCR檢測(cè)獲得的10株轉(zhuǎn)基因植株設(shè)計(jì)目的基因特異引物，經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出400bp的目的條帶，檢測(cè)到10株全為陽(yáng)性植株（圖4）。結(jié)果表明外源基因已經(jīng)整合到玉米基因組中。

3討論

對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化，國(guó)內(nèi)外報(bào)道大多數(shù)都是以幼胚作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體[5]，但是幼胚的取材受時(shí)間影響很大，一旦錯(cuò)過(guò)了最佳時(shí)期就很難使試驗(yàn)繼續(xù)進(jìn)行。而愈傷組織不受時(shí)間影響，可以長(zhǎng)期作為轉(zhuǎn)化的受體，而且能長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)。

玉米材料的不同對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化有很大的影響，有的材料能誘導(dǎo)出適合轉(zhuǎn)化的玉米材料，有的則不能。本試驗(yàn)用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化繼代3、4、5、6、7次的不同材料玉米愈傷組織，結(jié)果表明：HiⅡ的抗性愈傷率最高，其次是HiⅡB和HiⅡA，H99的最低，這與George等的研究結(jié)果[6-7]一致，即不同的玉米品種接受農(nóng)桿菌侵染的能力也不同，接受轉(zhuǎn)化的受體對(duì)品種的依賴性很強(qiáng)；基因型相同時(shí)，繼代3次的抗性愈傷率高于其他繼代次數(shù)，與余桂榮的試驗(yàn)結(jié)果相同；侵染前預(yù)培養(yǎng)愈傷組織的轉(zhuǎn)化頻率高于未預(yù)培養(yǎng)的，且預(yù)培養(yǎng)6d的侵染效果較好，這與伍曉麗等的研究結(jié)果[8]相一致。產(chǎn)生這些結(jié)果的原因可能有以下幾點(diǎn)：（1）基因型方面，B73和A188是良好的轉(zhuǎn)基因受體材料，HiⅡB和HiⅡA是B73與A188雜交得到的衍生系，HiⅡB誘導(dǎo)的愈傷組織較HiⅡA松散，HiⅡA外殼相對(duì)比較硬，HiⅡ是由HiⅡB與HiⅡA雜交所得到的，具有兩者的綜合優(yōu)點(diǎn)，為Ⅱ型愈傷組織，Ⅱ型愈傷的生長(zhǎng)速度非?？欤螤铑?lèi)似菜花，結(jié)構(gòu)松散，容易分化成苗[9]；而H99的愈傷組織大多為I型，外殼比較硬，不太容易擴(kuò)大培養(yǎng)，抗性愈傷率比較低。（2）在愈傷組織的整個(gè)生長(zhǎng)期間，前3次的生長(zhǎng)比較快，細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，3次以后由于代謝物質(zhì)的逐漸積累，篩選出的抗性愈傷較低，因而繼代3次的玉米愈傷組織侵染效率比較高。（3）侵染前預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間有利于愈傷的生理狀態(tài)達(dá)到良好的狀態(tài)，沒(méi)有預(yù)培養(yǎng)的愈傷在上次繼代到14d時(shí)，有可能會(huì)有少量的有毒物質(zhì)產(chǎn)生，而預(yù)培養(yǎng)一段時(shí)間的愈傷組織代謝比較旺盛，適于農(nóng)桿菌侵染。

農(nóng)桿菌濃度對(duì)侵染效率也有很大的影響。農(nóng)桿菌濃度過(guò)低時(shí)，吸附在細(xì)胞表面的農(nóng)桿菌過(guò)少而不能有效地將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物體內(nèi)，濃度過(guò)大時(shí)容易使愈傷組織污染。本研究表明，當(dāng)菌液濃度為D600nm=0.5～0.6時(shí)，HiⅡ愈傷組織的抗性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)最高值。

本試驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因體系對(duì)4種玉米材料的愈傷組織進(jìn)行侵染，在篩選過(guò)程中選擇出抗性愈傷組織，取其抗性愈傷的一部分提取DNA，并對(duì)其進(jìn)行PCR檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)出來(lái)的抗性愈傷一分為二，一部分進(jìn)行擴(kuò)繁，另一部分進(jìn)行再生出苗，再生出苗的植株進(jìn)行bar基因試紙條的檢測(cè)，進(jìn)一步從蛋白質(zhì)水平上對(duì)轉(zhuǎn)基因結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化后的轉(zhuǎn)基因體系極大地提高了轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)化率。

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