實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)血流感染常見(jiàn)病原菌的臨床應(yīng)用

井發(fā)紅，慕玉東，辛 娜，李敬梅，康 煒(西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 70077;陜西省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科;通訊作者，E-mail:kttw008@6．com)

成人和兒童菌血癥都是高發(fā)病率和高死亡率的疾病，每年世界范圍內(nèi)菌血癥患者有2 000萬(wàn)例［1］。因病原菌不能鑒定而應(yīng)用廣譜抗生素或不適當(dāng)抗生素治療所導(dǎo)致的死亡率非常高，美國(guó)血流感染的總體病死率可高達(dá)14%-63%，但在明確病原菌后采用針對(duì)性治療，其死亡率可降至5%-17%［2-4］，因此及時(shí)快速診斷病原菌對(duì)合理用藥、縮短療程等具有重要意義。迄今為止，血培養(yǎng)仍然是診斷血流感染的金標(biāo)準(zhǔn)［5］，它不僅可以檢測(cè)血液中有無(wú)病原菌，還可對(duì)分離出的病原菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，因此血培養(yǎng)對(duì)血流感染的診治具有重要意義。然而，血培養(yǎng)一般至少需要3-5 d的時(shí)間，且易受標(biāo)本質(zhì)量、標(biāo)本中病原體數(shù)量、培養(yǎng)條件以及抗生素治療等多種因素的影響，陽(yáng)性率較低;同時(shí)，有些病原體雖能被培養(yǎng)出，但應(yīng)用傳統(tǒng)的方法很難對(duì)其進(jìn)行鑒定，這些遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床對(duì)血流感染快速診斷和治療的需要［6］。近年來(lái)，分子生物學(xué)和基因診斷技術(shù)的不斷發(fā)展為血流感染的檢測(cè)提供了新的思路。病原菌的基因組較生化指標(biāo)穩(wěn)定，通過(guò)基因擴(kuò)增及其后續(xù)技術(shù)可以快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)病原菌。本研究主要構(gòu)建熔解曲線分析法，并進(jìn)行特異性驗(yàn)證。檢測(cè)不同拷貝濃度稀釋液進(jìn)行敏感性分析。利用絕對(duì)定量法測(cè)定血液及穿刺引流液中鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌的含量。

1 材料與方法

1．1 檢測(cè)菌種與PCR擴(kuò)增靶基因的確定

本研究選擇的標(biāo)準(zhǔn)菌株鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii A601)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae ATCC700603)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC 8558)由衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供。針對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌的ITS、肺炎克雷伯菌的phoE和表皮葡萄球菌的gseA基因作為PCR擴(kuò)增的靶基因。

1．2 引物設(shè)計(jì)

分別對(duì)靶基因序列使用Primer Primer5．0軟件設(shè)計(jì)引物，經(jīng)BLAST比對(duì)選擇特異性較高引物，引物均由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。實(shí)驗(yàn)中PCR擴(kuò)增所用靶基因、引物序列、產(chǎn)物大小和退火溫度(見(jiàn)表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)中PCR擴(kuò)增所用引物Table 1 Primers for PCR amplification

1．3 主要試劑與儀器

PCR反應(yīng)試劑(包括Taq酶及緩沖液，MgCl2、dNTP)以及DL1000 DNA Marker和pMD?18-T載體均為大連TaKaRa產(chǎn)品，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(離心柱型)和感受態(tài)DH5a均為北京天根產(chǎn)品，SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒為上海生工產(chǎn)品。SYBR Green Realtime PCR Master Mix是日本TOYOBO產(chǎn)品。CFX96 TM realtime定量PCR系統(tǒng):美國(guó)Bio-rad產(chǎn)品;PCR擴(kuò)增儀(GeneAmp PCR System 2720)為美國(guó)ABI產(chǎn)品;電泳儀(DYY6C)為北京六一產(chǎn)品;紫外凝膠成像系統(tǒng)(Ingenius LHR SYSTEM，200V)為英國(guó) Syngene產(chǎn)品;NanoPhotometerTM為德國(guó)IMPLEN產(chǎn)品。

1．4 細(xì)菌基因組DNA的提取與擴(kuò)增產(chǎn)物純化

細(xì)菌基因組DNA的提取:應(yīng)用“天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒”提取經(jīng)純培養(yǎng)后的標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA，用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA大小。

擴(kuò)增產(chǎn)物純化:用上海生工“SanPrep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒”對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

質(zhì)粒的提取:將DNA片段與pMD18-T載體的連接，然后將連接體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)菌DH5a上，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選挑取培養(yǎng)板上白色單菌落過(guò)夜培養(yǎng)待培養(yǎng)液明顯渾濁后準(zhǔn)備提取質(zhì)粒，應(yīng)用天根“TIAN-prep Mini Plasmid Kit”進(jìn)行質(zhì)粒提取，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取增菌后的菌液1 ml，由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1．5 引物的特異性驗(yàn)證

對(duì)上述引物用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照。常規(guī)PCR反應(yīng)的總體積為 50 μl，其中 10 × Buffer 5 μl，25 mol/L 的MgCl24 μl，2．5 mol/L 的 dNTP 4 μl，5 U/μl Taq 酶0．2 μl，上、下游引物各 1 μl，模板 DNA 4 μl，滅菌超純水30．8 ml。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s;56℃退火30 s;72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳的電壓為6 V/cm，采用溴化乙錠(EB)染色20 min，拍照保存。

1．6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用NanoPhotometerTM微量核酸/蛋白檢測(cè)儀測(cè)定所提重組質(zhì)粒濃度(ng/μl)，利用 Avogadro’s常數(shù)(1 mol溶液大約有6．022 141 5×1023拷貝數(shù))計(jì)算出溶液中質(zhì)?？截悢?shù)，為制作標(biāo)準(zhǔn)品原液。將原液進(jìn)行倍比稀釋，對(duì)倍比稀釋液進(jìn)行熔解曲線分析法實(shí)驗(yàn)。

1．7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

用鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌這三種特異性引物分別進(jìn)行熔解曲線分析法實(shí)驗(yàn)。20 μl反應(yīng)體系包括SYBR Green Realtime PCR Mix 10 μl，10 μmol/L 的上、下游引物各 0．8 μl，DNA 模板 2 μl，滅菌超純水 6．4 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性10 s;60℃退火15 s;72℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán);于60℃15 s后采集熒光信號(hào)，熔解曲線分析條件為65℃ 10 s，0．5℃/s升溫至95℃并收集熒光信號(hào)。通過(guò)軟件得到絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線(standard curve)、熔解曲線(melt curve)的Ct值、對(duì)數(shù)濃度值等數(shù)據(jù)。

1．8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)

用構(gòu)建好的熔解曲線法檢測(cè)血液及穿刺引流液中鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌的含量。

2 結(jié)果

2．1 引物特異性的驗(yàn)證

菌種特異性引物擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)菌株，可見(jiàn)其PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期DNA片段大小吻合(見(jiàn)圖1):鮑曼不動(dòng)桿菌208 bp，肺炎克雷伯菌142 bp，表皮葡萄球菌194 bp，且擴(kuò)增條帶亮度較高，反映引物特異性較好，陰性對(duì)照無(wú)污染。

圖1 特異性引物擴(kuò)增結(jié)果Figure 1 PCR results of specific primers

2．2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制結(jié)果

以肺炎克雷伯菌為例，將標(biāo)準(zhǔn)品原液按10倍倍比稀釋后做定量 PCR，得到5．80×108-5．80×103個(gè)拷貝的模板循環(huán)數(shù)與熒光強(qiáng)度的擴(kuò)增曲線，從圖2中可以看到擴(kuò)增曲線間距基本對(duì)等，與倍比稀釋的模板吻合。以各倍比稀釋拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫軸，反應(yīng)過(guò)程中達(dá)到熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱軸，得到檢測(cè)該菌的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，該曲線是檢測(cè)樣本的參照標(biāo)準(zhǔn)，參數(shù)為:E=88．7%，R=0．986，Slope=-3．625，熔解曲線分析為單峰，說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物單一，無(wú)非特異性擴(kuò)增，排除反應(yīng)過(guò)程中假陽(yáng)性結(jié)果的出現(xiàn)，熔解溫度為88．5℃(見(jiàn)圖4，5)。

2．3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果

定量分析血液標(biāo)本和穿刺引流液標(biāo)本中結(jié)果表明:三種菌在臨床血液標(biāo)本中的含量在103-107copy/ml之間，在穿刺引流液標(biāo)本中含量為104-108copy/ml(見(jiàn)表2)。

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR正在快速地替代傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)方法。該技術(shù)在封閉的反應(yīng)管中將PCR反應(yīng)與產(chǎn)物分析過(guò)程一次完成，并能自動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和數(shù)據(jù)分析，大大減少了交叉污染的幾率，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、定量精確、敏感度高且重復(fù)性好。

圖2 肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線Figure 2 Standard amplification curve of Klebsiella pneumoniae

圖3 肺炎克雷伯菌標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 3 Standard curve of Klebsiella pneumoniae

圖4 肺炎克雷伯菌熔解曲線Figure 4 Melting curve of Klebsiella pneumoniae

圖5 肺炎克雷伯菌熔解峰圖Figure 5 Peak melting curve of Klebsiella pneumoniae

表2 標(biāo)本中表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌定量結(jié)果 (copy/ml)Table 2 The quantitative RT-PCR results of Staphylococcus epidermidis，Klebsiella pneumoniae Acinetobacter baumannii(copy/ml)

目前，應(yīng)用于血流感染的分子定量測(cè)定方法較少，而培養(yǎng)方法計(jì)算的CFU只能代表在平板接種過(guò)程中存活下來(lái)的活的微生物而不能計(jì)數(shù)死細(xì)胞、不能形成菌落的細(xì)胞以及從破碎細(xì)胞中釋放出來(lái)的游離微生物DNA。因此，人們對(duì)血流感染病人血中病原菌DNA的真正含量知之甚少。

許多敗血癥病人被收治到ICU中進(jìn)行靶抗生素治療可以極大地減少死亡率。一份來(lái)自美國(guó)和加拿大15個(gè)ICU的2 600多病例的研究表明，從敗血癥休克開(kāi)始到有效地抗生素應(yīng)用前，敗血癥的死亡危險(xiǎn)率每小時(shí)增加6%-10%［7］。不幸的是，目前實(shí)驗(yàn)室鑒定和分型血流感染病原菌的方法太慢，得到培養(yǎng)及藥敏結(jié)果所需時(shí)間長(zhǎng)，不能為臨床提供及時(shí)的參考;而且，由于前期經(jīng)驗(yàn)性廣譜抗生素大量應(yīng)用、血中微生物含量低等原因，使得敗血癥病人的血培養(yǎng)往往呈現(xiàn)假陰性。據(jù)報(bào)道，腦膜炎球菌在未經(jīng)抗生素治療前，從血培養(yǎng)檢出率可達(dá)50%，而在經(jīng)過(guò)抗生素治療后的患者檢出率不足5%［8］。抗生素的大量應(yīng)用不僅導(dǎo)致培養(yǎng)陽(yáng)性率低，而且增加花費(fèi)，還可能導(dǎo)致病人抗生素中毒，并可能促進(jìn)微生物耐藥性的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)血流及穿刺引流液中的鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌進(jìn)行定量分析，結(jié)果顯示qRT-PCR方法可準(zhǔn)確、敏感地檢測(cè)臨床標(biāo)本中的細(xì)菌含量。實(shí)驗(yàn)中采用SYBR Green熒光染料的方法，該染料可以與DNA非特異性結(jié)合，為排除PCR反應(yīng)過(guò)程中可能形成的非特異性擴(kuò)增和引物二聚體等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，我們不斷優(yōu)化反應(yīng)體系和程序，并設(shè)定熔解曲線，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。同時(shí)，為了準(zhǔn)確定量，我們選擇了絕對(duì)定量的實(shí)驗(yàn)方案，目的是得到臨床標(biāo)本中細(xì)菌的絕對(duì)拷貝數(shù)。首先分別從標(biāo)本中和標(biāo)準(zhǔn)菌株中擴(kuò)增目的基因來(lái)制作定量標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)直接從標(biāo)本中擴(kuò)增目的基因來(lái)制作標(biāo)準(zhǔn)品的方法符合定量PCR實(shí)驗(yàn)的要求，特異性高、濃度穩(wěn)定、無(wú)非特異性片段等，因而可以作為實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品。完成三種細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作后，分別檢測(cè)了各菌在臨床標(biāo)本中的含量。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明血流細(xì)菌含量在103-107copy/ml之間，穿刺引流液中細(xì)菌含量在104-108copy/ml之間;引流液中的細(xì)菌含量比血液中要高。本部分實(shí)驗(yàn)為闡明菌量與感染的關(guān)系以及抗生素的應(yīng)用對(duì)血流中細(xì)菌量的影響奠定了基礎(chǔ)。

［1］Zaidi AK，Thaver D，A1i SA，et al．Palhogens associated wilh sepsis in newborns and young infants in developing countries［J］．Pediatr Infect Dis J，2009，28(Suppl1):10-18．

［2］Rangel-Frwusto MS．The epiderriology of bacterial Sepsis［J］．Infect Dis Clin North Am，1999，13(2):299-303．

［3］Weinstein MP，Towns ML，Quartey SM，et al．The clinical significance of positive blood cultures in the 1990s:a prospective comprehensive evaluation of the microbiology，epidemiology，and outcome of bactefemia and fungemiaia in adults［J］．Clin Infect Dis，1997，24(4):584-602．

［4］Zarrouk V，Habibi A，Zahar JR，et al．Blood stream infection in adults with sickle cell disease:association with venous catheters，Staphylococcus aureus，and bone-joint infections［J］．Medicine(Baltimore)，2006，85(1):43-48．

［5］Magadia RR，Weinstein MP．Laboratory diagnosis of bacteremia and fungemia［J］．Infect Dis Clin North Am，2001，15(4):1009-1024．

［6］周庭銀，倪語(yǔ)星，王明貴．血流感染實(shí)驗(yàn)診斷與臨床診治［M］．上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2011:41-42，108-109，120-121．

［7］Kumar A，Roberts D，Wood KE，et al．Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock［J］．Crit Care Med，2006，34(6):1589-1596．

［8］Newcombe J，Cartwright K，Palmer WH，et al．PCR of peripheral blood for diagnosis of meningococcal disease［J］．J Clin Microbiol，1996，34(7):1637-1640．