口服酪酸梭菌減輕哮喘小鼠氣道炎癥的研究

張 娟，魏 春，劉夢昀，黃建瓊，吳海霞，鄭躍杰，孫 新(第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院兒科，西安7003;深圳市兒童醫(yī)院呼吸科;通訊作者，E-mail:sunxin6@fmmu．edu．cn)

支氣管哮喘是世界范圍內(nèi)嚴重威脅公眾健康的慢性疾病之一，全球哮喘防治創(chuàng)議(GINA)委員會于2014年對哮喘的定義進行了重要更新，將哮喘定義為:“哮喘是一種以慢性氣道炎癥為特征的異質(zhì)性疾病，具有喘息、氣促、胸悶和咳嗽的呼吸道癥狀病史，伴有可變的呼氣氣流受限，呼吸道癥狀和強度可隨時間而變化”［1］。目前哮喘的發(fā)病率和死亡率正在逐年增長，但尚無有效的根治的方法，嚴重困擾著人類健康。關(guān)于哮喘發(fā)病機制的探索、哮喘新藥的研究與開發(fā)、新的治療方法的評價都依賴于動物實驗［2］。目前國內(nèi)外大多數(shù)實驗選取BALB/c小鼠建立哮喘模型，主要由于此種小鼠對于IgE介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)極其敏感［3］。益生菌(probiotics)一詞來源于“有益”(pro)和“生命”(bios)，聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織將其定義為:“當足量補充時，對宿主健康有益的活的微生物”［4］。益生菌的種類很多，常見的有酪酸梭菌、乳酸桿菌及雙歧桿菌等。酪酸梭菌是一種革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，作為微生態(tài)制劑有著廣泛的臨床作用，它不僅可以調(diào)理人體胃腸功能，大幅度降低偽膜性腸炎的發(fā)病率，而且對于菌群失調(diào)引起的腹瀉、抗生素相關(guān)性腸炎、便秘等都有良好療效［5］。盡管近年來國內(nèi)外有很多相關(guān)文獻報道益生菌對于哮喘等過敏性疾病具有潛在的臨床預(yù)防和治療作用。然而，目前關(guān)于酪酸梭菌對于哮喘等過敏性疾病的研究卻少有報道。本實驗旨在通過建立一個穩(wěn)定的小鼠哮喘模型，探討酪酸梭菌是否可以通過減少支氣管肺泡灌洗液(BALF)中白細胞總數(shù)及Th2細胞因子、降低血清中卵清蛋白(ovalbumin，OVA)特異性IgE及IgG1水平、改善肺組織病理變化來減輕哮喘小鼠的氣道炎癥，為哮喘的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實驗動物與分組

6周齡清潔級雄性BALB/c小鼠(第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供)隨機分為四組，每組10只，分別為對照組、哮喘模型組、酪酸梭菌預(yù)防組和酪酸梭菌治療組，飼養(yǎng)于第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部動物房，恒定室溫(21－25℃)，濕度50%－65%，光照10－12 h/d，不含OVA的飼料進行喂養(yǎng)，整個過程按動物保護和使用指南進行。

1．2 主要試劑及儀器

卵清蛋白 OVA(美國 Sigma公司)，氫氧化鋁(天津市天力化學(xué)試劑公司)，酪酸梭菌(山東科興生物制品有限公司)，空壓霧化器(歐姆龍大連有限公司)。

1．3 益生菌

酪酸梭菌于－20℃冰箱保存，使用時將其濃度調(diào)至5×108CFU/ml，即稱取5 g菌粉溶于10 ml生理鹽水混勻后分裝，－4℃保存。灌胃時每只小鼠200 μl。預(yù)防組及治療組分別于第0－14天和第15－28天采用酪酸梭菌溶液進行灌胃。哮喘模型組于第0－28天采用等量生理鹽水代替酪酸梭菌溶液灌胃。

1．4 哮喘模型的建立

動物致敏:除對照組外其余三組小鼠于第7天和第 14 天用 200 μl［100 μg OVA+1．5 mg Al(OH)3］生理鹽水溶液進行腹腔注射致敏。對照組小鼠采用僅含有Al(OH)3粉末的生理鹽水溶液，注射部位及劑量與實驗組相同。

動物激發(fā):用生理鹽水配制濃度為1%的OVA溶液作為霧化液。于第21－28天將模型組、預(yù)防組及治療組三組小鼠放在5 L自制的密閉容器中，以霧化液霧化吸入激發(fā)，使小鼠暴露在1%OVA氣霧中，每日1次，每次30 min。對照組小鼠在相同條件下以生理鹽水代替霧化液霧化吸入。

1．5 眼球血的收集及BALF中白細胞計數(shù)

在末次激發(fā)24 h后取小鼠眼球血后，將小鼠仰臥位固定，暴露氣管，用自制穿刺針進行氣管插管并固定，用0．8 ml滅菌的冷PBS溶液進行支氣管肺泡灌洗，10 s后回抽，重復(fù)3次(回抽率 ＞80%)，將回抽的BALF于4℃，2 500 r/min，離心5 min，回收上清置于－20℃保存?zhèn)溆?。? ml無菌PBS溶液重懸離心后的沉淀，取0．1 ml重懸液進行白細胞計數(shù)。

1．6 肺組織病理切片染色

肺泡灌洗完畢后，暴露小鼠胸廓，取小鼠肺組織固定于4 ml 4%多聚甲醛溶液中至少24 h，梯度乙醇脫水后常規(guī)石蠟包埋，切片(4 μm)，HE染色后光鏡下觀察。

1．7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 小鼠行為學(xué)觀察

模型組中大多數(shù)小鼠在霧化過程中都出現(xiàn)了煩躁不安，頭面部瘙癢，前肢抬縮，弓背抓臉，呼吸急促，腹肌抽搐，大小便失禁及安靜少動等哮喘急性發(fā)作的癥狀。對照組、預(yù)防組及治療組小鼠未見明顯異常行為。

2．2 各組小鼠BALF中白細胞計數(shù)比較

模型組小鼠BALF中白細胞總數(shù)明顯高于對照組(P＜0．01)，提示哮喘小鼠氣道炎癥較對照組明顯。與模型組相比，預(yù)防組及治療組小鼠BALF中白細胞總數(shù)明顯降低(P＜0．01，見表1)。

表1 四組BALF中白細胞總數(shù)的比較(±s)Table 1 The total white blood cell count in the BALF in four groups(±s)

表1 四組BALF中白細胞總數(shù)的比較(±s)Table 1 The total white blood cell count in the BALF in four groups(±s)

與對照組相比，*P＜0．01;與模型組相比，#P＜0．01

組別 n 白細胞總數(shù)(105/ml)H P對照組5 0．75 ±0．47 16．374 0．001模型組 6 41．75 ±9．16*預(yù)防組 7 1．29 ±0．86#治療組 7 2．88 ±2．41#

2．3 小鼠肺組織病理變化

空白對照組小鼠病理切片基本正常;哮喘模型組小鼠肺組織病理切片(HE染色)可見小支氣管及伴行血管周圍有較多的中性粒細胞及吞噬細胞，部分肺泡間隔融合形成肺氣腫;預(yù)防組及治療組小鼠肺泡腔中仍可見少量中性粒細胞及吞噬細胞浸潤(見圖1)。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化(HE染色，×200)Figure 1 Pathological changes of lung tissues from each group(HE staining，×200)

2．4 BALF中細胞因子的檢測結(jié)果

與對照組相比，哮喘模型組小鼠 IL-4(P＜0．01)及 IL-13(P ＜0．001)水平明顯升高，酪酸梭菌可以明顯降低哮喘小鼠IL-4(P＜0．01)及IL-13(P＜0．001)水平(見圖2)。BALF中并未測出 IL-10及 INF-γ。

圖2 小鼠BALF中IL-4及IL-13的濃度Figure 2 The concentrations of IL-4 and IL-13 in the BALF in four groups

2．5 血清中IL-10的檢測結(jié)果

與對照組相比，模型組小鼠血中IL-10水平明顯降低(P＜0．01)，預(yù)防組及治療組小鼠血中IL-10水平明顯升高(P＜0．01，見圖3)。

2．6 血清中抗OVA特異性IgE及IgG1水平

與對照組相比，模型組小鼠血中 IgE(P＜0．001)及 IgG1(P ＜0．01)水平顯著升高，表明小鼠哮喘模型復(fù)制成功。預(yù)防組及治療組較模型組血中IgE(P ＜0．001)及 IgG1(P ＜0．01)的水平明顯降低(見圖4)。

3 討論

圖3 各組小鼠血清中IL-10的濃度Figure 3 The concentrations of serum IL-10 in four groups

圖4 各組小鼠血清抗OVA特異性IgE及IgG1水平Figure 4 The levels of serm OVA specific IgE and IgG1in four groups

支氣管哮喘是嚴重影響公眾健康的慢性疾病之一，據(jù)估計全球約有3億哮喘患者，其中我國超過2千萬，且兒童哮喘患病率明顯高于成人，是致使兒童生活質(zhì)量下降的主要疾病影響因素［6］。第三次中國城市兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國城市兒童哮喘患病率為 0．48%－7．57%，平均為3．02%，與10年前相比增加了52．8%，且其患病率仍呈明顯上升趨勢［7］。因此，哮喘的發(fā)病機制及防治的研究一直是各國研究的熱點。

眾多研究表明，體內(nèi)Th1/Th2比例失調(diào)是導(dǎo)致哮喘發(fā)病的重要因素，在哮喘發(fā)病過程中Th2細胞功能亢進，Th1細胞功能降低［8］。Th2細胞主要產(chǎn)生IL-4、IL-5及IL-13等細胞因子，而Th1細胞主要分泌INF-γ等細胞因子。IL-4、IFN-γ分別是Th2和Th1細胞的特征性細胞因子。IL-4是由Th2細胞產(chǎn)生，其在Th1、Th2細胞調(diào)控中起到重要的作用，可促進B細胞增殖及活化，同時能調(diào)節(jié)抗體同型轉(zhuǎn)換效應(yīng)，促進IgE、IgG1生成，并具有抑制IgG2a、IgG2b的作用。IFN-γ主要由活化的T細胞及吞噬細胞產(chǎn)生，具有免疫調(diào)節(jié)作用，并可誘導(dǎo)Th0細胞向Th1細胞轉(zhuǎn)化，抑制Th2細胞生成［9］。起初，IL-10被認定為是一種Th2細胞因子，但進一步研究表明IL-10并不屬于Th2或Treg細胞而是一種廣泛表達的細胞因子。許多細胞都可以表達 IL-10，例如 Th1、Th2、Th17、Treg、CD8+T 以及 B 細胞［10］。近年來發(fā)現(xiàn)IL-10其實是一種具有抗炎作用的細胞因子，由Th細胞分泌，在體內(nèi)表現(xiàn)出較強的免疫抑制和抗炎效應(yīng)。調(diào)控免疫反應(yīng)的CD4+CD25+Treg已經(jīng)成為免疫抑制治療的焦點，大量相關(guān)文獻報道 CD4+CD25+Treg可通過分泌細胞因子IL-10等方式抑制免疫反應(yīng)答，進而使機體產(chǎn)生免疫耐受。另有研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)IL-10表達減少的小鼠其CD4+CD25+Treg也相應(yīng)減少，表現(xiàn)出較嚴重的哮喘炎癥反應(yīng)［11，12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，哮喘組小鼠BALF中炎癥細胞總數(shù)明顯升高(P＜0．01)，IL-4(P ＜0．01)及 IL-13(P ＜0．001)水平顯著升高;血清中OVA特異性 IgE(P＜0．001)及 IgG1(P＜0．01)水平也明顯升高，IL-10水平卻明顯降低(P＜0．01)。酪酸梭菌可顯著降低哮喘小鼠BALF中炎癥細胞總數(shù)(P ＜0．01)、IL-4(P ＜0．01)、IL-13(P ＜0．001)水平，明顯降低血清中OVA特異性IgE(P＜0．001)和 IgG1(P ＜0．01)水平，一定程度升高血清中IL-10水平(P＜0．01)。哮喘模型組小鼠肺組織病理切片可見小支氣管及伴行血管周圍有較多的中性粒細胞及吞噬細胞，部分肺泡間隔融合并形成肺氣腫。對照組小鼠病理切片基本正常。預(yù)防組及治療組小鼠局部肺泡腔中仍可見少量中性粒細胞及吞噬細胞浸潤。

近年來許多動物實驗和臨床試驗都有類似報道，即益生菌對于哮喘等過敏性疾病具有免疫防治作用。例如，Yu等［13］發(fā)現(xiàn)致敏前口服鼠李糖乳桿菌(Lcr35)可以顯著減輕哮喘小鼠模型的氣道炎癥，降低氣道高反應(yīng)性，即Lcr35對小鼠哮喘具有預(yù)防作用。Sagar等［14］通過建立小鼠哮喘模型并給予益生菌和激素治療，發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌(M-16V)和鼠李糖乳桿菌(NutRes1)具有與布地奈德相似的強烈的抗炎屬性，表明益生菌或許可以對兒童哮喘產(chǎn)生重要的治療作用。近期研究發(fā)現(xiàn)哮喘小鼠口服鼠李糖乳桿菌(GG)不僅可以明顯降低氣道高反應(yīng)性，顯著減少肺泡灌洗液和血清中Th2細胞因子水平，而且還可以明顯降低血清中抗OVA特異性IgE水平，減少肺組織中基質(zhì)金屬蛋白酶－9的表達及炎細胞的浸潤［15］。van der Aa 等［16］應(yīng)用合生素(雙歧桿菌M-16V、90%短鏈低聚半乳糖及10%長鏈果寡糖)進行為期12周的隨機對照試驗，并對參與者進行了干預(yù)后1年的隨訪，結(jié)果顯示合生素顯著降低了過敏性皮膚炎嬰兒的哮喘樣癥狀發(fā)病率和哮喘藥物使用率。我們的實驗結(jié)論與這些實驗結(jié)果相一致。

綜上所述，酪酸梭菌可以通過抑制過敏誘導(dǎo)的Th2細胞因子和OVA特異性IgE及IgG1的產(chǎn)生、降低小鼠BALF中炎細胞總數(shù)、改善肺部病理變化減輕哮喘小鼠氣道炎癥。本研究證實酪酸梭菌作為一種常見的益生菌，可能具有防治哮喘的作用，但其臨床作用及其機制仍需進一步研究。

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