參地顆粒對(duì)慢性腎炎脾腎虧虛證患者NF-κB 信號(hào)通路的干預(yù)作用

王億平， 朋紅霞， 王 東， 金 華， 劉家生， 任克軍， 魏 玲， 王立媛

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥230031)

慢性腎炎 (chronic glomerulonephritis，CGN)在我國引起終末期腎病仍居病因之首，蛋白尿是其病情進(jìn)展的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，積極減少蛋白尿可阻止或延緩CGN 的病程進(jìn)展［1-2］。CGN 的發(fā)病機(jī)制與免疫炎癥因素和非免疫非炎癥因素都有密切關(guān)系，一般認(rèn)為免疫炎癥因素為起始因素。研究表明［3］NF-κB 在很多腎小球疾病中起關(guān)鍵作用，特別是免疫介導(dǎo)的腎小球疾病。氧化應(yīng)激能夠介導(dǎo)NF-κB信號(hào)活化［4］，啟動(dòng)免疫炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腎臟損害。本研究檢測(cè)CGN 脾腎虧虛證患者血清活性氧(ROS)、超氧化物歧化酶 (SOD)、丙二醛(MDA)水平和核因子-κB p65 (NF-κB p65)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 (MCP-1)、纖維連接蛋白(FN)的含有量，并觀察參地顆粒的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 病例選擇標(biāo)準(zhǔn)

1.1.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照陸再英，鐘南山主編的第7 版內(nèi)科學(xué)的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］。

1.1.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥治療慢性腎炎臨床研究指導(dǎo)原則》［6］制定。主癥:神疲乏力，腰背酸痛，納差，水腫，胃脘部不適;次癥:大便溏薄，小便頻數(shù)，夜尿增多，舌淡有齒痕，脈沉細(xì)。具備主癥3 項(xiàng)，或主癥2 項(xiàng)、次癥2 項(xiàng)以上者，即可診斷。

1.1.3 中醫(yī)癥狀量化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 參照《中藥新藥治療慢性腎炎臨床研究指導(dǎo)原則》［6］制定，按輕、中、重度，分別計(jì)2、4、6 分。

1.1.4 病例納入標(biāo)準(zhǔn) ①符合CGN 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn);②腎小球?yàn)V過率＞60 mL/min;③24 h 尿蛋白定量在3 g 以下;④年齡在18 歲以上，65 歲以下;⑤自愿參加本試驗(yàn)，并在知情同意書上簽字。

1.1.5 病例排除標(biāo)準(zhǔn) ①不符合病例納入標(biāo)準(zhǔn);②不按規(guī)定服藥或口服糖皮質(zhì)激素等藥物，影響療效判定;③妊娠或哺乳期的婦女;④有嚴(yán)重肝、心、腦等疾病，影響療效判定者。

1.2 研究對(duì)象及分組 選取我科2012 年6 月～2013 年6 月符合納入標(biāo)準(zhǔn)的50 例住院患者，按其入院先后順序隨機(jī)分為治療組25 例和對(duì)照組25例，治療過程中治療組失訪3 例，對(duì)照組失訪1例，最終完成46 例。治療組22 例中男10 例，女12 例，年齡22 ～59 歲，病程3 個(gè)月～7 年，合并血壓升高13 例。對(duì)照組24 例中男14 例，女10例，年齡19 ～62 歲，病程6 個(gè)月～8 年，合并血壓升高15 例。兩組患者性別、年齡、病程等比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＞0.05)，具有可比性。另選取20 例同期來我院體檢正常者作為正常組。

1.3 治療方法 治療組口服參地顆粒(院內(nèi)制劑，安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研制，皖藥制字BZ20080025)，每次1 袋(10 g)，每日3 次，溫水沖服。對(duì)照組服用貝那普利片(北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字H20030514)，每次10 mg，每日1 次，療程均為12 周。

1.4 觀察指標(biāo) 治療前后患者中醫(yī)證候積分值的變化，24 h 尿蛋白定量及血清ROS、SOD、MDA、NF-κB p65、MCP-1、FN 水平變化，并與正常組比較。采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法，主要試劑ROS、SOD、MDA、NF-κB p65 及FN 均來源于上海源葉生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為H34376、H32667、H10256、H32538、H30145;MCP-1 來源于上?？婆d生物科技有限公司，批號(hào)為Kx10136。

1.5 療效判定標(biāo)準(zhǔn) 依據(jù)《中藥新藥治療慢性腎炎臨床研究指導(dǎo)原則》制定［6］。臨床療效分臨床控制、顯效、有效和無效。中醫(yī)證候療效分臨床痊愈、顯效、有效和無效。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，采用t 檢驗(yàn)和單因素方差分析，等級(jí)資料采用Ridit 分析，P ＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者臨床疾病療效比較 治療組臨床疾病總有效率為81.82%，高于對(duì)照組66.67%，兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.05)。見表1。

表1 兩組患者臨床療效比較［例(%)］Tab.1 Comparison of clinical efficiency between two groups ［n (%)］

2.2 兩組患者中醫(yī)證候療效比較 治療組中醫(yī)證候總有效率77.27%，高于對(duì)照組37.50%，兩組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P ＜0.01)。見表2。

表2 兩組患者中醫(yī)證候療效比較［例(%)］Tab.2 Comparison between two groups on clinical efficiency according to traditional Chinese medicine standards［n (%)］

2.3 兩組患者治療前后24 h 尿蛋白定量比較 與治療前相比，兩組24 h 尿蛋白定量治療8 周后顯著降低，12 周后降低更為顯著，優(yōu)于對(duì)照組(P ＜0.05)。見表3。

表3 兩組患者治療前后24 h 尿蛋白定量比較(±s，g/24 h)Tab.3 Quantitative comparison between two groups on 24 h urinary protein before and after treatment (±s，g/24 h)

表3 兩組患者治療前后24 h 尿蛋白定量比較(±s，g/24 h)Tab.3 Quantitative comparison between two groups on 24 h urinary protein before and after treatment (±s，g/24 h)

注:與同期對(duì)照組比較，△P ＜0.05;與本組治療前比較，#P ＜0.05

組別 例數(shù) 治療前 治療后8 周 治療后12周對(duì)照組 24 1.23 ±0.63 0.87 ±0.43# 0.65 ±0.31#治療組 22 1.05 ±0.59 0.66 ±0.28# 0.47 ±0.25△#

2.4 各組患者治療前后血清ROS、SOD、MDA 水平比較 兩組患者治療前血清ROS、MDA 水平均高于正常組，血清SOD 水平低于正常組(P ＜0.05)，治療后兩組血清ROS、MDA 水平均較治療前降低，而血清SOD 水平均較治療前升高(P ＜0.05)，治療組優(yōu)于對(duì)照組(P ＜0.05)。見表4。

表4 各組患者治療前后血清ROS、SOD、MDA 水平變化(±s)Tab.4 Changes in levels of ROS，SOD and MDA before and after treatment(±s)

表4 各組患者治療前后血清ROS、SOD、MDA 水平變化(±s)Tab.4 Changes in levels of ROS，SOD and MDA before and after treatment(±s)

注:與正常組比較，▲P ＜0.05;與同期對(duì)照組比較，△P ＜0.05;與本組治療前比較，* P ＜0.05

組別 例數(shù) ROS/(IU·mL -1)SOD/(ng·mL -1)MDA/(nmol·mL -1)治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后正常組 20 327.28 ±97.19 — 195.25 ±38.21 — 3.73 ±1.04—對(duì)照組 24 511.72 ±100.02▲445.04 ±97.42* 108.63 ±41.56▲130.07 ±30.72* 6.99 ±1.98▲ 5.85 ±1.23*治療組 22 523.38 ±91.39▲386.34 ±93.12△＊ 101.52 ±39.59▲153.86 ±45.19△＊ 6.28 ±1.20▲ 4.97 ±1.66△＊

2.5 各組患者治療前后血清NF-κB p65、MCP-1、FN 水平比較 治療組和對(duì)照組患者治療前血清NF-κB p65、MCP-1 水平均高于正常組，而血清FN水平低于正常組(P ＜0.05)。治療后兩組血清NF-κB p65、MCP-1 水平均較治療前降低，而血清FN 水平均較治療前升高(P ＜0.05)，治療組優(yōu)于對(duì)照組(P ＜0.05)。見表5。

表5 各組患者治療前后血清NF-κB p65、MCP-1、FN 水平變化(±s)Tab.5 Changes in levels of NF-κB p65，MCP-1 and FN before and after treatment (±s)

表5 各組患者治療前后血清NF-κB p65、MCP-1、FN 水平變化(±s)Tab.5 Changes in levels of NF-κB p65，MCP-1 and FN before and after treatment (±s)

注:與正常組比較，▲P ＜0.05;與同期對(duì)照組比較，△P ＜0.05;與本組治療前比較，* P ＜0.05

組別 例數(shù) NF-κB p65/(ng·mL -1)MCP-1/(pg·mL -1)FN/(μg·mL -1)治療前 治療后 治療前 治療后 治療前 治療后正常組 20 1.21 ±0.62 — 87.55 ±20.44 — 328.60 ±101.26—對(duì)照組 24 8.63 ±3.56▲ 6.01 ±1.63* 151.37 ±31.08▲ 128.34 ±41.72* 167.09 ±80.44▲216.46 ±83.73*治療組 22 7.75 ±2.82▲ 5.07 ±1.09△＊ 138.09 ±29.02▲ 102.44 ±33.12△＊ 195.91 ±87.90▲288.43 ±93.78△＊

3 討論

CGN 的病變部位主要在脾腎兩臟，基本病機(jī)為脾腎虧虛、精微下注。 《素問》中“飲入于胃，游溢精氣，上輸于脾，脾氣散精，上歸于肺，通調(diào)水道，下輸膀胱，水精四布，五經(jīng)并行”、“腎者，封藏之本，精之處也”，概括了脾腎兩臟的功能:脾氣散精，灌注全身，腎主藏精，使體內(nèi)的精微物質(zhì)正常分布與代謝。當(dāng)脾腎兩臟虛損時(shí)，則會(huì)發(fā)生精微物質(zhì)的分布、代謝異常，蛋白質(zhì)和血液均為人體精微物質(zhì)，脾虛不能統(tǒng)攝血液，血不循經(jīng)則外泄，腎虛封藏功能失職，則精微下泄，而成蛋白尿和血尿。反過來蛋白質(zhì)、血液遺泄日久，又可造成脾腎虧虛更甚，如此形成惡性循環(huán)。且血不循經(jīng)，離經(jīng)之血形成瘀血，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。脾腎為先后天之本，兩者相互為用，相互依存，故治療CGN 脾腎虧虛證，應(yīng)以補(bǔ)益脾腎為主，兼能固攝精微。前期研究［7-9］表明參地顆粒治療CGN 脾腎虧虛證患者，取得良好的臨床療效。參地顆粒以人參為君藥，大補(bǔ)元?dú)?、固攝精微;茯苓、熟地為臣藥，健脾益腎;佐以五味子、桑螵蛸，以加強(qiáng)固攝精微之力;病久必夾瘀，故使以川芎活血化瘀。諸藥合用，共湊健脾益腎、固攝精微之功。

氧化應(yīng)激造成腎臟損傷的過程包括以下兩個(gè)方面:一方面，ROS 對(duì)腎臟有直接損傷作用，主要是ROS 使脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等細(xì)胞分子過氧化，從而使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能遭到破壞［10］。另一方面，也是更重要的，ROS 還可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)(如NF-κB、TGF-β1/Smads、P38MAPK、JNK/SAPK 等通路［11］)，通過ROS 對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的活化引起免疫炎癥細(xì)胞黏附、聚積，促進(jìn)疾病的發(fā)展。在以上幾個(gè)信號(hào)通路中，目前比較認(rèn)可的是NF-κB 信號(hào)通路［12］。NF-κB 調(diào)控多種下游細(xì)胞因子和趨化因子(如TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8 和MCP-1 等)及黏附分子(如VCAM-1 和ICAM-1)的表達(dá)，這些因子在免疫炎癥反應(yīng)中起調(diào)控作用，參與免疫和炎癥細(xì)胞的趨化、浸潤、增殖、分化等，同時(shí)，這些因子又可以反過來刺激NF-κB 的活化，這種正反饋效應(yīng)導(dǎo)致炎癥反應(yīng)信號(hào)不斷放大，從而加重組織損傷［13］。MCP-1 屬于趨化因子家族中C-C 亞家族，單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞等都可表達(dá)MCP-1，在腎臟主要是由腎小管上皮細(xì)胞和腎小球系膜細(xì)胞產(chǎn)生，MCP-1 調(diào)控單核巨噬細(xì)胞的遷移和浸潤，募集至炎癥部位，參與炎癥的發(fā)生，單核巨噬細(xì)胞浸潤及其引起的炎癥反應(yīng)在各種腎臟疾病過程中都有參與［14］。纖維連接蛋白(FN)是一種高分子非膠原糖蛋白，在腎臟主要是系膜細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分。研究表明FN 是在損傷組織中最早出現(xiàn)的基質(zhì)蛋白成分［15］，在炎癥或免疫損傷過程中，F(xiàn)N 生成增多，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)在腎臟局部堆積，過度聚積的細(xì)胞外基質(zhì)。因此，F(xiàn)N 的表達(dá)程度可反應(yīng)細(xì)胞外基質(zhì)聚積的程度。

本研究結(jié)果顯示，CGN 脾腎虧虛證患者血清ROS、MDA 水平和NF-κB p65、MCP-1 水平高于正常組，血清SOD 活力和FN 水平低于正常組(P ＜0.05)，說明氧化應(yīng)激介導(dǎo)NF-κB 信號(hào)活化，產(chǎn)生炎癥介質(zhì)MCP-1，參與了CGN 脾腎虧虛證的發(fā)生發(fā)展。參地顆粒能改善患者臨床癥狀，降低24 h尿蛋白定量，其機(jī)理與通過抑制CGN 脾腎虧虛證患者的氧化應(yīng)激，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，抑制NF-κB 信號(hào)活化，下調(diào)MCP-1 表達(dá)有關(guān)。

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