Plackett-Burman 聯(lián)合星點(diǎn)設(shè)計優(yōu)選甜瓜蒂中葫蘆素的提取工藝

郭夢鴻， 孫玉琦 ， 劉 影， 顏冬雪， 沈麗萍

(遼寧醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州121001)

甜瓜蒂為葫蘆科植物甜瓜Cucumis melo L. 的干燥成熟果蒂，別名瓜蒂、苦丁香、瓜丁等。具有涌吐痰食、除濕退黃、保肝抗癌之功效。甜瓜蒂中含有一系列高度氧化的四環(huán)三萜類化合物——葫蘆素成分，包括葫蘆素B、E、D，異葫蘆素B，葫蘆素B 葡萄糖苷等［1］。葫蘆素類成分具有多種潛在藥理作用［2-3］，廣泛用于抗炎和抗癌研究。其中，葫蘆素B 為其主要活性成分，具有保肝抗癌、影響細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增強(qiáng)毛細(xì)血管通透性、改善微循環(huán)等功效［4-5］。研究表明，葫蘆素B 具有確切的抗腫瘤作用，可用于肝癌、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌等［6-10］多種腫瘤疾病，并且其抗癌作用具有生物功能選擇性［11］。

Plackett-Burman 設(shè)計可通過較少次數(shù)實(shí)驗從眾多因素中篩選主要影響因素，從而避免在后期優(yōu)化時由于部分因子影響不顯著而浪費(fèi)資源［12］。星點(diǎn)設(shè)計(CCD)-響應(yīng)面法(RSM)［13］可研究變量間相互作用，是一種多元非線性擬合的設(shè)計方法。通過描繪因素的響應(yīng)面及疊加等高線圖，能夠在設(shè)定的實(shí)驗區(qū)域內(nèi)，找到一個明確的函數(shù)式來表達(dá)各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，從而找到整個區(qū)域中考察因素的最佳組合和響應(yīng)的最優(yōu)值［14］。本研究基于Plackett-Burman 實(shí)驗設(shè)計，篩選影響提取效果的主要因素，結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面法，優(yōu)選甜瓜蒂中葫蘆素的提取工藝，并驗證方法的可行性，為甜瓜蒂中葫蘆素成分的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 儀器與材料

UV-2550 型UV-Vis 分光光度計(日本島津公司);L-2000 Elite 高效液相色譜儀，配有L-2130高壓恒流泵，L-2455 DAD 檢測器，D-2000 Elite 色譜數(shù)據(jù)處理工作站(日本日立公司);RE-52A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);AL204 電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)。

葫蘆素B 對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111945-201301，純度96.9%)。甜瓜蒂(產(chǎn)地河北省保定市)。色譜純甲醇(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司);香草醛(上海瀚思化工有限公司);冰醋酸、濃硫酸、甲醇、無水乙醇均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 UV-Vis 分光光度法測定總葫蘆素

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取葫蘆素B 對照品10.0 mg，置50 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得葫蘆素B 對照品溶液(0.2 mg/mL)。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取不同體積葫蘆素B 對照品溶液分別置10 mL 量瓶中，依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液2.0 mL、濃硫酸1.0 mL，70 ℃恒溫反應(yīng)30 min，冰醋酸定容，搖勻，543 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)(A1)，葫蘆素B 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(C1)，得回歸方程A1=21.163C1+0.097 6 (r = 0.999 6)，葫蘆素B 在4.0 ～64.0 μg/mL 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 精密度試驗 精密量取葫蘆素B 對照品溶液0.8 mL 于10 mL 量瓶中，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，連續(xù)測定6 次，計算RSD 值為0.93%。結(jié)果表明儀器的精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗 精密量取葫蘆素B 對照品溶液0.8 mL 于10 mL 量瓶中，按“2.1.2”項下方法測定吸光度，測定時間為60 min，時間間隔為10 min。結(jié)果顯示在60 min 內(nèi)吸光度的RSD 為4.96%，而在10 ～30 min 內(nèi)的RSD 為1.05%，表明該方法在30 min 內(nèi)穩(wěn)定，超過30 min 后穩(wěn)定性下降。

2.1.5 加樣回收率試驗 精密吸取成分含有量已知供試品溶液0.1 mL 于10 mL 量瓶中，平行9 份，分別加入低、中、高質(zhì)量濃度葫蘆素B 對照品溶液，按“2.1.2”項下方法測定吸光度。平均回收率為99.57%，RSD 為1.26%。

2.2 HPLC 法測定葫蘆素B［15］

2.2.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱 (200 mm×4.6 mm，5 μm);流動相為甲醇-水(61 ∶39);檢測波長228 nm;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

2.2.2 方法學(xué)考察［15］按“2.2.1”項下色譜條件，分別對線性關(guān)系、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率進(jìn)行考察，得回歸方程A2=47 622C2-39 234 (r = 0.999 6)，線性范圍4.0 ～64.0 μg/mL，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率結(jié)果如表1。

表1 方法學(xué)考察結(jié)果Tab.1 Result of methodological study

結(jié)果表明精密度良好，供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定，且方法重復(fù)性較好，加樣回收率結(jié)果符合定量測定要求。

2.3 樣品制備與測定 取甜瓜蒂藥材粗粉約20.0 g，精密稱定，置于250 mL 圓底燒瓶中，加入一定量不同體積分?jǐn)?shù)乙醇，分次提取，過濾，合并濾液，減壓濃縮，干燥，得干燥粉末，稱定質(zhì)量。精密稱取干燥粉末50.0 mg 置10 mL 量瓶中，甲醇溶解、定容，得供試品溶液。精密量取供試品溶液0.1 mL，置10 mL 量瓶中，按“2.1.2”項下方法制備樣品，于543 nm 處測定吸光度，根據(jù)回歸方程計算總葫蘆素含有量(以葫蘆素B 計)。另取供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進(jìn)行檢測，計算葫蘆素B 含有量?？偤J素提取率(%) =提取物質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%。

2.4 Plackett-Burman 實(shí)驗設(shè)計篩選主要影響因素

2.4.1 Plackett-Burman 實(shí)驗設(shè)計及結(jié)果 選用Plackett-Burman 設(shè)計對甜瓜蒂中葫蘆素成分提取工藝影響因素的顯著性進(jìn)行考察。實(shí)驗設(shè)計5 個因素(A 乙醇體積分?jǐn)?shù)，B 料液比，C 提取時間，D 提取次數(shù)，E 提取溫度)，6 個空白因素(F，G，H，I，J，K)。根據(jù)單因素考察結(jié)果確定每個因素高、低兩種水平(+1，-1)，以總葫蘆素含有量、葫蘆素B 含有量、總葫蘆素提取率為響應(yīng)值。Plackett-Burman 實(shí)驗設(shè)計因素及水平見表2，結(jié)果見表3。

表2 Plackett-Burman 設(shè)計因素及水平Tab.2 Factors and levels of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman 設(shè)計結(jié)果Tab.3 Result of Plackett-Burman design

2.4.2 分析與結(jié)論 采用Design-Expert 8.0 軟件對各因素進(jìn)行顯著性分析，通過Pareto 圖［16］判定各因素顯著性，每個因素效應(yīng)的大小由條形圖所占比例表示，各因素顯著性分析結(jié)果見圖1。

圖1 響應(yīng)值的Pareto 圖Fig.1 Pareto charts of response values

通過以上結(jié)果可知，影響因素中乙醇體積分?jǐn)?shù)、時間、溫度、次數(shù)對響應(yīng)值有交叉性影響，其中提取次數(shù)對葫蘆素B 含有量和總葫蘆素提取率表現(xiàn)出顯著性則選擇提取3 次，而料液比對各響應(yīng)值均不具有顯著性，結(jié)合實(shí)際意義選擇料液比為1 ∶8。由此，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)、時間、溫度作為顯著性影響因素。

2.5 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗

2.5.1 星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面實(shí)驗設(shè)計及結(jié)果 根據(jù)Plackett-Burman 實(shí)驗結(jié)果結(jié)合星點(diǎn)設(shè)計-響應(yīng)面原理，以乙醇體積分?jǐn)?shù) (X1)、時間 (X2)、溫度(X3)為考察因素，總葫蘆素含有量(Y1)、葫蘆素B 含有量(Y2)、總葫蘆素提取率(Y3)為響應(yīng)值進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗。分析因素及水平見表4，實(shí)驗設(shè)計方案與結(jié)果見表5。

表4 星點(diǎn)設(shè)計因素及水平Tab.4 Factors and levels of CCD

2.5.2 工藝優(yōu)化與預(yù)測 應(yīng)用Design-Expert 8.0實(shí)驗設(shè)計軟件，分別繪制三維效應(yīng)面圖(圖2)。

采用效應(yīng)面等高線疊加法對葫蘆素成分提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，先固定總葫蘆素及葫蘆素B 含有量模型中次要因素X3，考察顯著因素X1、X2對Y1、Y2、Y3的交互影響，再固定總葫蘆素提取率模型中次要因素X2，考察顯著因素X1、X3對Y1、Y2、Y3的交互影響，分別繪制疊加等高線圖，確定提取條件的最優(yōu)化區(qū)域(圖3)，結(jié)合以上三維效應(yīng)面圖，優(yōu)化得到最佳工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)98.95%，提取時間 77.84 min，提取溫度75.95 ℃。此條件下，各響應(yīng)值的預(yù)測理論值分別為總葫蘆素20.57%，葫蘆素B 13.69%，總葫蘆素提取率11.93%?？紤]到實(shí)驗的可操作性，最終確定提取條件為乙醇為無水乙醇，時間90 min，溫度75 ℃。

表5 星點(diǎn)設(shè)計實(shí)驗結(jié)果Tab.5 Result of CCD

圖2 各響應(yīng)值三維效應(yīng)面圖Fig.2 3D analysis charts of response values

圖3 優(yōu)化模型等高線疊加圖Fig.3 Overlapping figures of the contour plots of optimum model

2.5.3 提取工藝驗證 為了確定模型預(yù)測與實(shí)驗結(jié)果一致性進(jìn)行驗證試驗。提取工藝為8 倍量無水乙醇，75 ℃提取3 次，90 min/次，平行3 次，取平均值，計算偏差率［偏差率= (真實(shí)值-預(yù)測值)/預(yù)測值× 100%］。實(shí)驗結(jié)果見表6。

表6 葫蘆素類成分提取工藝驗證結(jié)果(n=3)Tab.6 Result of verification test for cucurbitacins extraction technology (n=3)

3 討論

為了保證實(shí)驗的精度，縮小Plackett-Burman實(shí)驗設(shè)計各因素范圍，前期實(shí)驗中，以總葫蘆素含有量、葫蘆素B 含有量及總葫蘆素提取率為指標(biāo)，對影響因素(提取溶劑、提取溶劑濃度、料液比、提取時間、提取次數(shù)、提取溫度)進(jìn)行了單因素考察，確定乙醇為提取溶劑較好，同時明確了各影響因素的試驗范圍。

實(shí)驗中采用Plackett-Burman 實(shí)驗設(shè)計聯(lián)合星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化甜瓜蒂中葫蘆素成分的提取工藝，可以評價因素與響應(yīng)值間的非線性關(guān)系，使精確度更高、指導(dǎo)性更強(qiáng)。Pareto 圖篩選顯著因素更加直觀，操作簡便易于理解，利于實(shí)驗的顯著性分析。對星點(diǎn)設(shè)計-效應(yīng)面實(shí)驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，由二次多元回歸方程可知，P 值均為P ＜0.000 1，表明模型顯著;且模型相關(guān)系數(shù)R2值均較大，說明可信度良好，方程與實(shí)際情況擬合較好。同時，通過方差分析，確定各響應(yīng)值的主要影響因素，利于等高線疊加分析［17］。該分析方法，可實(shí)現(xiàn)成分含有量與提取率的同步優(yōu)化，實(shí)驗中對多個指標(biāo)考察，形成多因素綜合評價，得到具有實(shí)際應(yīng)用價值的葫蘆素成分提取的工藝參數(shù)。

驗證結(jié)果表明，實(shí)驗中所建立的數(shù)學(xué)模型具有較佳的預(yù)測性，實(shí)驗設(shè)計有較高的可靠性，為葫蘆素類成分的分離純化提供了實(shí)驗基礎(chǔ)。

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