響應(yīng)面法優(yōu)化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝

葛 飛， 石貝杰， 龔 倩， 張慧敏， 桂 琳

（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，安徽蕪湖241000）

響應(yīng)面法優(yōu)化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝

葛 飛， 石貝杰1， 龔 倩1， 張慧敏1， 桂 琳2*

（1.安徽工程大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，安徽 蕪湖241000；2.皖南醫(yī)學(xué)院微生物與免疫學(xué)教研室，安徽蕪湖241000）

目的利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝。方法在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度和65%乙醇用量 （料液比）為影響因素，以菌絲體中腺苷提取率為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。結(jié)果高雄山蟲草菌絲體中腺苷的最佳超聲提取條件為：超聲功率433W，提取時(shí)間31 min，提取溫度41℃，65%乙醇用量34 mL即料液比1∶34 g/mL。在此條件下，高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率可達(dá)1.608 5 mg/g。結(jié)論

高雄山蟲草；腺苷；超聲提??；響應(yīng)面分析法

細(xì)腳擬青霉Paecilomyces tenuipes（Peck）Samson是高雄山蟲草Cordyceps takaomontana Yakushiji et Kumazaw的無性型［1］，是一種分布廣泛的、重要的昆蟲病原真菌［2］。腺苷是細(xì)腳擬青霉發(fā)酵菌絲體的主要有效成分之一［3］。相關(guān)研究表明，細(xì)腳擬青霉代謝產(chǎn)物具有多種藥理活性和生物學(xué)功能，被認(rèn)為是天然蟲草的有效替代品之一［4-8］。

查閱相關(guān)文獻(xiàn)資料發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)外學(xué)者對細(xì)腳擬青霉及其代謝產(chǎn)物的藥理作用、發(fā)酵條件、有效成分含量分析等方面開展了廣泛的研究。李寶劍等從細(xì)胞水平初步探討了細(xì)腳擬青霉多糖對乙型肝炎病毒的抑制作用及其機(jī)制［9］。葛飛等研究了中藥大黃對細(xì)腳擬青霉液態(tài)發(fā)酵菌體生長及產(chǎn)胞內(nèi)腺苷的影響［10］。劉慧娟等對細(xì)腳擬青霉液體栽培及氨基酸成分分析進(jìn)行了研究［11］。陳安徽等以冬蟲夏草生藥為對照品對細(xì)腳擬青霉發(fā)酵菌絲體中核苷類化學(xué)成分進(jìn)行了分析；同時(shí)，利用DPPH法對其發(fā)酵液和菌絲體的自由基清除活性進(jìn)行了研究［12-13］。但有關(guān)高雄山蟲草液態(tài)發(fā)酵菌絲體中腺苷的提取工藝研究未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。超聲波提取是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)及熱效應(yīng)，通過增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度，增大介質(zhì)的穿透力以提取天然產(chǎn)物有效成分的方法，具有設(shè)備簡單，操作方便，提取時(shí)間短，提取率高，成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，受到越來越多的重視［14-16］。本研究利用響應(yīng)面法對高雄山蟲草無性型——細(xì)腳擬青霉液態(tài)發(fā)酵菌絲體中腺苷的超聲提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 高雄山蟲草菌絲體由其無性型菌株細(xì)腳擬青霉進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵獲取，細(xì)腳擬青霉菌株由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)樊美珍教授饋贈(zèng)，安徽工程大學(xué)微生物發(fā)酵安徽省工程技術(shù)研究中心保藏。甲醇為色譜純，磷酸鹽為國產(chǎn)分析純。腺苷對照品購自美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備 BIOTECH-10JSA 3L-10L發(fā)酵罐（上海保興生物設(shè)備工程有限公司）；Waters1525高效液相色譜儀（美國Waters公司）；QHZ-123B組合式全溫度振蕩培養(yǎng)箱（江蘇省太倉市華美生化儀器廠）；HN-30AL型超聲波清洗儀（上海汗諾儀器有限公司）；FreeZone12冷凍干燥系統(tǒng)（美國LABCONCO公司）；L550型臺(tái)式離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；WK-600A高速粉碎機(jī) （青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司）；AL204型分析天平 （梅特勒-托利多 （上海）儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 菌絲體預(yù)處理 將液體深層發(fā)酵獲得的高雄山蟲草菌絲體經(jīng)真空冷凍干燥后，粉碎，過60目篩，封口袋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取腺苷0.010 0 g置于10mL量瓶，用65%乙醇溶液溶解定容，分別配置成質(zhì)量濃度為0.100 0、0.200 0、0.400 0、0.600 0、0.800 0、1.000 mg/ML腺苷溶液，作為對照品溶液。

1.3.3 菌絲體中腺苷的超聲提取方法 準(zhǔn)確稱取1.000 0 g經(jīng)預(yù)處理后的菌絲體，在40 kHz的超聲頻率下按試驗(yàn)設(shè)定條件提取胞內(nèi)腺苷，提取液過濾后，濾液用65%乙醇定容，再經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾后，所得濾液即為菌絲體中腺苷粗提液，稀釋后進(jìn)行HPLC分析。

1.3.4 腺苷的測定方法 根據(jù) 《中國藥典》2010年版中介紹的方法，利用HPLC法測定高雄山蟲草菌絲體中腺苷的含有量［17］。流動(dòng)相為pH6.5的磷酸鹽緩沖液-甲醇 （體積比85∶15）；色譜柱為C18，體積流量1mL/min，檢測波長260 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量20μL。

1.3.5 菌絲體中腺苷提取率的計(jì)算 腺苷提取率=腺苷質(zhì)量（mg）/菌絲體質(zhì)量 （g）

1.3.6 單因素提取試驗(yàn)設(shè)計(jì) 分別以不同的超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度和65%乙醇用量 （即料液比）作為單因素試驗(yàn)影響因子，考察各單因素對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響。

1.3.7 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用BBD-RSM法設(shè)計(jì)優(yōu)化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝參數(shù)。設(shè)計(jì)因素水平見表1。

表1 試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲功率對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

選擇提取時(shí)間為25 min，提取溫度45℃，料液比為1∶30（高雄山蟲草菌絲體：65%乙醇溶液，g/mL），分別用180、240、300、360、420、480和540 W的超聲功率提取高雄山蟲草菌絲體中腺苷，考察超聲功率對胞內(nèi)腺苷提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲功率對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

由圖1可見，當(dāng)超聲功率在180～420W的區(qū)間范圍內(nèi)時(shí)，腺苷提取率隨超聲功率的增大而增加。但超聲功率超過420W時(shí)，提取率反而下降，可能是由于超聲波的強(qiáng)烈空化效應(yīng)使腺苷結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致提取率降低。因此，超聲功率為420 W時(shí)，較有利于高雄山蟲草菌絲體中腺苷的提取。

2.1.2 提取時(shí)間對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

選擇超聲功率為420W，提取溫度45℃，料液比為1∶30（高雄山蟲草菌絲體：65%乙醇溶液，g/mL），分別提取10、15、20、25、30、35和40 min，考察提取時(shí)間對胞內(nèi)腺苷提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，提取時(shí)間對菌絲體腺苷提取效果有較大影響。提取時(shí)間在10～30 min范圍內(nèi)，隨提取時(shí)間的延長，腺苷提取率增加明顯；但30 min后，隨提取時(shí)間的延長，腺苷提取率反而略有下降。因此，確定較佳提取時(shí)間為30 Min。

圖2 提取時(shí)間對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

2.1.3 提取溫度對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

選擇超聲功率為420W，提取時(shí)間30min，料液比為1∶30（高雄山蟲草菌絲體：65%乙醇溶液，g/mL），分別在25、30、35、40、45和50℃條件下，進(jìn)行胞內(nèi)腺苷的提取，考察提取溫度對胞內(nèi)腺苷提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

由圖3可見，在25～40℃范圍內(nèi)時(shí)，隨溫度升高高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率逐步提高，當(dāng)溫度高于40℃時(shí)，提取率反而減小。因此，確定較佳提取溫度為40℃。2.1.4 料液比對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響選擇超聲功率為420W，提取時(shí)間30 min，提取溫度40℃，分別在料液比 （高雄山蟲草菌絲體：65%乙醇溶液，g/mL）為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50條件下，進(jìn)行胞內(nèi)腺苷的提取，考察料液比對胞內(nèi)腺苷提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在料液比小于1∶30時(shí)，隨料液比的增加，腺苷提取率增加明顯；在料液比大于1∶30時(shí)，腺苷提取率反而下降。因此，料液比以1∶30較為適宜。

圖4 料液比對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率的影響

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析 以腺苷提取率（mg/g）為響應(yīng)值，用Design-Expert 8.0.6.1軟件對獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可得如下二次回歸方程：Y= 1.59+0.069A+0.044B+0.036C+0.085D+0.041AB-0.040AC-0.00525AD+0.018BC+0.0035BD-0.024CD-0.16A2-0.14B2-0.15C2-0.10D2，結(jié)果見表2。對二次回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

由表3可知，回歸模型達(dá)到極顯著水平P＜0.000 1，而誤差項(xiàng)不顯著，說明回歸方程與實(shí)際情況吻合得較好，試驗(yàn)誤差小。因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析?；貧w模型各項(xiàng)的方差分析還表明，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2的置信度均在95%水平以上，說明這些因素在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中均為顯著項(xiàng)，即超聲功率（A）、提取時(shí)間 （B）、提取溫度 （C）和65%乙醇用量（D）均對實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較大影響。從各變量F值的大小，可以看出影響高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取效果的各因素按大小排序依次為65%乙醇用量 （即料液比） ＞微波功率＞提取時(shí)間＞提取溫度。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 Box-Behnken Design響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

2.3 響應(yīng)面分析 經(jīng)響應(yīng)面軟件分析，可得到超聲功率（A）、提取時(shí)間 （B）、提取溫度 （C）和65%乙醇用量（D）四個(gè)因素兩兩之間相互影響的顯著程度，結(jié)果表明，超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度和65%乙醇用量4個(gè)因素彼此之間的交互作用不顯著。

為確定各因素的最佳取值，用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行數(shù)值優(yōu)化分析，得出回歸模型存在最大值點(diǎn)，即最佳試驗(yàn)條件。經(jīng)分析，最佳提取條件為超聲功率433.07 W、萃取時(shí)間30.98 min、提取溫度40.36℃和65%乙醇用量34.00 mL。在此條件下，高雄山蟲草菌絲體腺苷提取率為1.617 27mg/g?？紤]實(shí)驗(yàn)的可操作性，將各提取工藝參數(shù)修正為超聲功率433 W、萃取時(shí)間31 min、提取溫度41℃和65%乙醇用量34 mL（即料液比34∶1 mL/g）。依據(jù)響應(yīng)面分析獲取修正后的最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果腺苷平均提取率為1.608 5 mg/g，實(shí)測平均值與理論值的誤差在1%以內(nèi)，說明實(shí)驗(yàn)值與理論值有較好的擬合性，獲取的最佳工藝參數(shù)具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面分析法對高雄山蟲草菌絲體中腺苷的超聲提取工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，超聲功率、提取時(shí)間、提取溫度和料液比對高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率均有顯著影響，最佳工藝條件為：超聲功率433W，提取時(shí)間31 min，提取溫度41℃，65%乙醇用量34 mL即料液比1∶34 g/mL。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取率為1.608 5 mg/g，回歸模型擬合度高，可用于優(yōu)化高雄山蟲草菌絲體中腺苷的提取工藝條件，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。超聲提取方法簡單，具有提取效率高，操作簡單，時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，是一種較理想的提取高雄山蟲草菌絲體中腺苷的方法。

［1］Shimizu D.Color iconography of vegetable wasps and plant worms［M］.Tokyo：Seibundo Shikosha，1994：230.

［2］榮躍文，徐 莉，汪小艷，等.高雄山蟲草無性型細(xì)腳擬青霉的核型分析［J］.菌物學(xué)報(bào)，2010，29（1）：31-36.

［3］Nilanonta C，Isaka M，Kittakoop P，et al.Antimycobacterial and antip lasmodial cyclodepsipeptides froMthe insectpathogenic fungus Paecilomyces tenuipes BCC 1614［J］.Planta Med，2000，66（8）：756-758.

［4］Shin K H，LiMSS，Lee SH，etal.Antioxidant and immunostimulating activities of the fruiting bodies of Paecilomyces japonica，a new type of Cordyceps sp［J］.Ann N Y Acad Sci， 2001，928：261-273.

［5］Chung E J，Choi K，KiMH W，et al.Analysis of cell cycle gene expression responding to acetoxyscirpendiol isolated froMPaecilomyces tenuipes［J］.Biol PharMBull，2003，26（1）：32-36.

［6］Kikuchi H，Miyagawa Y，Sahashi Y，et al.Novel spirocyclic trichothecanes，spirotenuipesine A and B，isolated froMentomopathogenic fungus，Paecilomyces tenuipes［J］.JOrg Chem，2004，69（2）：352-356.

［7］Takano F，Yahagi N，Yahagi R，et al.The liquid culture filtrates of Paecilomyces tenuipes（Peck）Samson（=Isaria japonica Yasuda）and Paecilomyces cicadae（Miquel）Samson（= Isaria sinclairii（Berk.）Llond）regulate Th1 and Th2 cytokine response in murine Peyerˊs patch cells in vitro and ex vivo［J］. Int J Immunopharmacol，2005，5（5）：903-916.

［8］Li CR，Li Z Z，F(xiàn)an MZ，etal.The composition of Hirsutella sinensis，anamorph of Cordycepssinensis［J］.JFood Compos Anal，2006，19（8）：800-805.

［9］李寶劍，金麗琴，左江成.細(xì)腳擬青霉多糖抗乙型肝炎病毒的體外實(shí)驗(yàn)研究［J］.中藥材，2007，30（2）：200-202.

［10］葛 飛，高櫻萍，桂 琳，等.中藥大黃對細(xì)腳擬青霉液態(tài)發(fā)酵菌體生長及產(chǎn)胞內(nèi)腺苷的影響［J］.中藥材，2012，35（7）：1025-2028.

［11］劉慧娟，鄭永標(biāo)，陳丹霞，等.細(xì)腳擬青霉液體栽培及氨基酸成分分析［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（1）：21-22.

［12］陳安徽，邵 穎，樊美珍，等.細(xì)腳擬青霉深層發(fā)酵菌絲體核苷類成分分析［J］.食品科學(xué)，2009，30（6）：235-237.

［13］陳安徽，陳宏偉，邵 穎，等.細(xì)腳擬青霉活性成分分析及清除自由基活性研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（13）：25-28.

［14］石恩慧，李 紅，谷明燦，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲提取板栗總苞多酚工藝條件［J］.中國食品學(xué)報(bào)，2013，13（5）：69-76.

［15］林志娟，陳 永，尤 麗，等.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取太子參多糖工藝研究［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2013，25（6）：846-850.

［16］王 宇，張 生，王少明，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化澤蘭中樺木酸的超聲輔助提取工藝［J］.中成藥，2013，35（11）：2541-2545.

［17］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：106.

R284.2

：B

：1001-1528（2015）05-1123-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.046

2014-07-18

安徽省高等學(xué)校優(yōu)秀青年人才基金項(xiàng)目 （2011SQRL079）；安徽省高等學(xué)校省級(jí)自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目 （KJ2013A049）作者簡介：葛 飛（1978—），男，博士，副教授，研究方向?yàn)槲⑸镔Y源開發(fā)與利用。E-mail：gerrylin@126.com

*通信作者：桂 琳（1980—），女，副教授，研究方向?yàn)閼?yīng)用微生物學(xué)。E-mail：gerrylinlin@126.com

超聲提取高雄山蟲草菌絲體中腺苷提取效率較高，時(shí)間較短，本實(shí)驗(yàn)確定的超聲提取工藝可用于高雄山蟲草菌絲體中腺苷的提取。