基于NF-κB通路探討疏肝健脾含藥血清對(duì)LPS刺激下大鼠肝細(xì)胞、Kup ffer細(xì)胞炎癥損傷保護(hù)作用機(jī)制研究

韓 莉， 龔享文， 楊欽河*， 閆海震， 張玉佩， 李媛媛， 徐擁建， 張金文，林春梅

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510632；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632）

基于NF-κB通路探討疏肝健脾含藥血清對(duì)LPS刺激下大鼠肝細(xì)胞、Kup ffer細(xì)胞炎癥損傷保護(hù)作用機(jī)制研究

韓 莉1， 龔享文2， 楊欽河2*， 閆海震2， 張玉佩2， 李媛媛2， 徐擁建2， 張金文2，林春梅2

（1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東廣州510632；2.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510632）

目的基于核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（nuclear transcription factor-kappaB，NF-κB）信號(hào)通路探討脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）刺激大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞炎癥損傷以及疏肝健脾含藥血清的保護(hù)作用。方法通過(guò)體外培養(yǎng)以及免疫熒光鑒定SD大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞，利用LPS刺激大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，酶聯(lián)免疫法檢測(cè)肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞培養(yǎng)上清液中白介素-1（interleukin-1，IL-1）、人血清淀粉樣蛋白（seruMamyloid A，SSA）的表達(dá)，Western blot法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果每只大鼠通過(guò)純化后獲得肝細(xì)胞數(shù)量1.5×108～2.0×108個(gè)，Kupffer細(xì)胞數(shù)量0.5×107～1.0×107個(gè)，Typan blue染色測(cè)定肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞活力均可達(dá)到95%以上。LPS組肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞較空白血清組IL-1、SSA水平均有顯著升高 （P＜0.01）。而與LPS組比較，藥物干預(yù)組可顯著降低 （P＜0.01）。肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞的蛋白表明，與空白血清組比較，LPS組肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞NF-κB、IκB及磷酸化IKKβ蛋白表達(dá)均有顯著升高（P＜0.01）；與LPS組比較，疏肝健脾方藥含藥血清能顯著下調(diào)肝細(xì)胞IκB及p-IKKβ蛋白的蛋白表達(dá)水平（P＜0.01），但NF-κB蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），疏肝健脾含藥血清能下調(diào)Kupffer細(xì)胞NF-κB、IκB及p-IKKβ蛋白表達(dá)（P＜0.01）。結(jié)論疏肝健脾含藥血清能夠?qū)PS刺激大鼠肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞炎癥損傷產(chǎn)生保護(hù)作用，其機(jī)制可能與NF-κB信號(hào)通路相關(guān)。

疏肝健脾方藥；NF-κB通路；肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞；LPS刺激；炎癥損傷；含藥血清

疏肝健脾方藥由參苓白術(shù)散和柴胡疏肝散組成，其具有疏肝健脾，理氣祛濕的臨床療效，既往研究表明，疏肝健脾方能夠起到改善非酒精性脂肪性肝病患者臨床癥狀、調(diào)節(jié)肝功以及降低血脂的效果［1］。其可能與疏肝健脾方藥能夠通過(guò)肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞NF-κB通路，使IL-1、TNF-α、IL-6等炎癥介質(zhì)表達(dá)降低，從而減輕炎癥損傷相關(guān)［2-4］，但其具體途徑有待于進(jìn)一步研究。本次研究基于體外培養(yǎng)大鼠肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞，通過(guò)疏肝健脾含藥血清進(jìn)行干預(yù)，從體外實(shí)驗(yàn)角度探討疏肝健脾方藥作用途徑及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 選用SPF級(jí)SD大鼠30只，雌雄各半，體質(zhì)量 （200±20）g之間，購(gòu)自暨南大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理中心，許可證號(hào)SYXK（粵）2012-0117。各組大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法可分為正常組、細(xì)胞提取組，含藥血清提取組，每組各10只。

1.2 藥物及動(dòng)物分組 疏肝健脾方藥是參苓白術(shù)散及柴胡疏肝散按1∶1比例的組合而成。參苓白術(shù)散：茯苓15 g、白術(shù)15 g、人參15 g、山藥15 g、白扁豆12 g、蓮子9 g、薏苡仁9 g、炙甘草9 g、砂仁6 g、桔梗6 g。柴胡疏肝散：柴胡6 g、陳皮6 g、枳殼5 g、香附5 g、白芍5 g、川芎5 g、炙甘草3 g。兩方均為中藥配方顆粒劑，由中國(guó)深圳華潤(rùn)三九公司提供，各方藥物劑量和方劑組成參考國(guó)家《方劑學(xué)》教材［5］。疏肝健脾方藥組含藥血清的制備參考李儀奎等［6-7］的方法，其劑量為59.5 g/kg，該劑量是在體實(shí)驗(yàn)劑量11.9 g/kg的5倍［8］，而正常組及細(xì)胞提取組給予等體積的生理鹽水灌胃。

1.3 試劑與儀器 胎牛血清（購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司）；Rabbit polyclonal to CK 18（Lot：20110823）、Goat anti-Rabbit IgG（H+L），F(xiàn)ITC conjugated Rabbit polyclonal to ED1（Lot：100346）（購(gòu)自中國(guó)鎮(zhèn)江厚普生物科技有限公司），IV型膠原酶 （購(gòu)自美國(guó)Gbico公司）；LPS（Lot# 072M4100V）（購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）；IL-1試劑盒 （購(gòu)自中國(guó)上海依科賽生物制品有限公司）、SSA試劑盒 （購(gòu)自中國(guó)上海藍(lán)基生物科技有限公司）；NF-κB p65抗體、IKKβ抗體、p-IKKβ抗體（購(gòu)自美國(guó)CST公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司）；ELISA檢測(cè)儀（購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司）；冷凍離心機(jī)（購(gòu)自德國(guó)Hamburg公司）；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) （購(gòu)自美國(guó)BIORAD公司）。

1.4 含藥血清制備 SD大鼠常規(guī)喂養(yǎng)1周。第8天起開(kāi)始灌胃給予干預(yù)措施 （分別給予藥物和生理鹽水），連續(xù)給予3 d，每天2次，每12 h一次。干預(yù)結(jié)束后，通過(guò)腹主動(dòng)脈采血，通過(guò)3 000 r/min離心后分離血清，而后熱滅活處理，0.22μm微孔濾膜進(jìn)行過(guò)濾除去細(xì)菌，冰凍保存。

1.5 細(xì)胞提取及培養(yǎng) 大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞分離與鑒定：采用離體循環(huán)灌注，差速離心法提取大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞，具體方法參照本課題組前期方案［9］，分離獲得肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞，將其接種在細(xì)胞培養(yǎng)瓶，并置于37℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.6 LPS刺激肝細(xì)胞及Kup ffer細(xì)胞及藥物干預(yù) 將大鼠肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞分為6組，每組6孔，具體干預(yù)方案：空白血清組 （A組）：20%空白血清；LPS組 （B組）：20%空白血清+LPS（40 mg/L）；疏肝健脾組 （C組）：20%疏肝健脾含藥血清+LPS（40mg/L）。

1.7 指標(biāo)檢測(cè)

1.7.1 顯微鏡觀察肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞形態(tài)、狀態(tài)及免疫熒光鑒定 Typan blue染色后，應(yīng)用倒置相差顯微鏡，在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上對(duì)所獲細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)計(jì)數(shù)，并鏡下觀察大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞狀態(tài)，運(yùn)用免疫熒光對(duì)大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

1.7.2 ELISA法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞及Kup ffer細(xì)胞上清IL-1、SSA 當(dāng)每孔大鼠肝細(xì)胞及Kupffer數(shù)量分別不少于1×104個(gè)時(shí)，加入不含血清的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，之后再依據(jù)各組既定的干預(yù)方案添加藥物至所需的目標(biāo)濃度后，再分別將大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞放回細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后分別吸取大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞上清，保存?zhèn)溆?。用ELISA法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞及Kup ffer細(xì)胞上清IL-1、SSA的表達(dá)水平。

1.7.3 Western blot法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞NF-κB相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平 取適量的細(xì)胞裂解液，在使用前3～5 Min內(nèi)加入苯甲基磺酰氟，使得苯甲基磺酰氟最終濃度可以達(dá)到1 mmol/L。按照5×106～10×106個(gè)肝細(xì)胞或Kupffer細(xì)胞加入1 ML蛋白質(zhì)裂解液，4℃，10 000～14 000×g，離心5～10 min，吸取上清，留下肝細(xì)胞或Kupffer細(xì)胞的沉淀備用。蛋白含量的測(cè)定選用碧云天BCA蛋白濃度試劑盒，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)。肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞樣本通過(guò)凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗，孵育，4℃過(guò)夜，洗滌，二抗，再孵育及洗滌，化學(xué)發(fā)光，曝光，顯影，定影等步驟，再對(duì)結(jié)果進(jìn)行光密度掃描分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSSForWindows13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，各組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞數(shù)量 每只大鼠所獲肝細(xì)胞數(shù)量為1.5×108～2.0×108個(gè)，Kupffer細(xì)胞數(shù)量為0.5×107～1.0×107個(gè)。吸凈細(xì)胞培養(yǎng)基后，采用PBS進(jìn)行細(xì)胞沖洗，再用胰蛋白酶進(jìn)行消化，后行臺(tái)盼藍(lán)染色，測(cè)定肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞的活力均可達(dá)95%以上。

2.2 細(xì)胞形態(tài)以及熒光鑒定 倒置相差顯微鏡下大鼠肝細(xì)胞呈圓形或橢圓形，邊界清晰，色澤光亮，體積增大，邊緣伸展（圖1-A）。Kupffer細(xì)胞呈圓點(diǎn)形狀，體積較肝細(xì)胞小，貼壁后Kupffer細(xì)胞呈梭形，部分有偽足 （圖1-B）。CK18對(duì)肝細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光鑒定，肝細(xì)胞釋放出綠色熒光，CK18陽(yáng)性表達(dá)，提示為肝細(xì)胞 （圖1-D）。采用ED1對(duì)Kupffer細(xì)胞做免疫熒光鑒定，可見(jiàn)梭形的Kupffer細(xì)胞呈綠色熒光，ED1陽(yáng)性表達(dá)，提示為Kup ffer細(xì)胞（圖1-D）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)及免疫熒光鑒定

2.3 細(xì)胞狀態(tài)

2.3.1 肝細(xì)胞形態(tài) 空白血清組肝細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，色澤光亮，部分肝細(xì)胞體積明顯增大，呈現(xiàn)細(xì)胞分裂增殖，而LPS組可見(jiàn)部分肝細(xì)胞脫落，肝細(xì)胞漿里出現(xiàn)大小不一的空泡，細(xì)胞胞漿的顏色明顯變淡，部分肝細(xì)胞里的胞核消失，肝細(xì)胞形態(tài)明顯不規(guī)則，疏肝健脾組與空白血清組比較未見(jiàn)顯著差異 （見(jiàn)圖2）。

2.3.2 Kupffer細(xì)胞形態(tài) 空白血清組Kupffer細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，少見(jiàn)細(xì)胞脫落，細(xì)胞多有偽足，呈健康的梭形細(xì)胞形態(tài)。LPS組可見(jiàn)大量細(xì)胞脫落或細(xì)胞攣縮成小圓點(diǎn)，貼壁細(xì)胞極少，細(xì)胞核不可見(jiàn)，偽足基本全部消失。疏肝健脾方組與空白血清組比較未見(jiàn)明顯差異 （見(jiàn)圖3）。

2.4 ELISA法檢測(cè)肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞上清液中IL-1，SSA的表達(dá)水平 LPS組與空白血清組比較，肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞IL-1、SSA的表達(dá)水平均有顯著升高（P＜0.01）。疏肝健脾組與LPS組比較，肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞中IL-1、SSA的表達(dá)水平呈顯著降低 （P＜0.01），見(jiàn)圖4、5。

圖2 肝細(xì)胞形態(tài)

圖3 Kup ffer細(xì)胞形態(tài)

2.5 Western blot法檢測(cè)大鼠肝細(xì)胞NF-κB相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平 LPS組與空白血清組比較，肝細(xì)胞NF-κB、IκB、IKKβ蛋白表達(dá)均有顯著升高 （P＜0.01）；疏肝健脾組與LPS組比較，疏肝健脾含藥血清不能下調(diào)肝細(xì)胞NF-κB蛋白下調(diào)（P＞0.05），能下調(diào)肝細(xì)胞IκB、IKKβ的蛋白表達(dá)水平，相互間比較有顯著差異 （P＜0.01），見(jiàn)圖6。

圖4 肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞IL-1表達(dá)

圖5 肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞SSA表達(dá)

圖6 肝細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白灰度值及表達(dá)水平比較

2.6 Western blot法檢測(cè)大鼠Kupffer細(xì)胞NF-KB相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平 LPS組與空白血清組比較：Kupffer細(xì)胞NF-κB、IκB、IKKβ蛋白表達(dá)均有顯著升高（P＜0.01）；疏肝健脾組與LPS組比較：疏肝健脾含藥血清能下調(diào)NF-κB、IκB、IKKβ蛋白下調(diào)（P＜0.01），見(jiàn)圖7。

圖7 Kup ffer細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白灰度值及表達(dá)水平比較

3 討論

前期研究表明，長(zhǎng)期高脂飼料喂養(yǎng)能夠誘導(dǎo)大鼠肝組織呈現(xiàn)典型NASH炎癥損傷病理改變，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。 “腸-肝”軸學(xué)說(shuō)可能有助于該現(xiàn)象的闡釋，也給NASH的發(fā)病機(jī)制的深入研究提供了新的方向［10-11］。研究表明，高脂飲食可造成腸內(nèi)養(yǎng)料來(lái)源的減少、改變腸道的細(xì)菌氧化還原狀態(tài)以及破壞菌群的微環(huán)境，從而影響腸道菌群的構(gòu)成［12-14］。腸道微生態(tài)的破壞可以導(dǎo)致腸道內(nèi)糞便中擬桿菌等有害菌增加，而雙歧桿菌等益生菌減少［15-16］。大量腸道寄存的陰性桿菌可以釋放大量?jī)?nèi)毒素（尤其是LPS），通過(guò)腸-肝血液循環(huán)進(jìn)入肝臟，激活Kupffer細(xì)胞以及誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生和增加。同時(shí)腸道細(xì)菌性質(zhì)和數(shù)量的變化也可導(dǎo)致腸道通透性增高以及腸道內(nèi)毒素易位，誘導(dǎo)肝臟多種炎性細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄基因及細(xì)胞因子的激活［17-18］。LPS來(lái)源于革蘭氏陰性菌外膜，是腸源性內(nèi)毒素最重要的組成部分之一。本研究表明，LPS能夠刺激肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生炎癥損傷，誘導(dǎo)炎癥因子IL-1，SSA表達(dá)明顯增加，并較LPS組有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。提示：LPS能夠?qū)ν瑫r(shí)誘導(dǎo)肝細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞兩種細(xì)胞產(chǎn)生炎癥損傷。這與Zenewicz，Zeng等的研究結(jié)果相一致［19-20］。

前期研究表明高脂飲食誘導(dǎo)NASH肝組織炎癥損傷與IKKβ/NF-κB信號(hào)通路活化密切相關(guān)，并且肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞NF-κB、IκB蛋白及IKKβ磷酸化表達(dá)明顯增高［2-3，21］。本研究也表明在LPS的刺激下能夠激活I(lǐng)κB蛋白、NF-κB蛋白增加并使IKKβ磷酸化、并較對(duì)照組有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.01）。這與前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。提示：LPS通過(guò)NF-κB信號(hào)通路在NASH發(fā)病中重要的作用。其具體作用機(jī)制可能與LPS刺激可以激活I(lǐng)KK復(fù)合物相關(guān)。IκB激酶（IKK）復(fù)合物是激活NF-κB信號(hào)通路主要調(diào)節(jié)器［22］。IκB激酶復(fù)合物包含兩個(gè)催化亞基：IKKα和IKKβ以及調(diào)節(jié)亞基IKKγ，其通過(guò)磷酸化IκB蛋白介導(dǎo)NF-κB活化響應(yīng)于各種刺激。LPS刺激IκB蛋白磷酸化，泛素化，使NF-κB細(xì)胞核定位點(diǎn)暴露出來(lái)，進(jìn)入細(xì)胞核后參與NF-κB依賴的基因的調(diào)節(jié)［23-24］。激活的NF-κB釋放大量炎癥介質(zhì)又反饋加強(qiáng)IKKβ活化，形成IKKβ-NF-κB惡性循環(huán)而加重肝臟炎癥損害［25］。

既往研究表明：疏肝健脾方藥能夠通過(guò)肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)NASH炎癥損傷發(fā)揮保護(hù)作用，但其作用途徑有待于進(jìn)一步研究［2-3］。中藥化學(xué)研究表明，疏肝健脾方藥含有橙皮苷、阿魏酸、柚皮苷等活性成分，而上述成分被證實(shí)具有的抗炎作用［26］。含藥血清用于體外細(xì)胞培養(yǎng)將為疏肝健脾方藥的作用途徑提供了新的研究方向。將藥物經(jīng)口給藥后，取其含藥血清作為藥物源加入到離體的反應(yīng)系統(tǒng)中從而研究其含藥血清的藥理作用，更加能夠反映藥物在體內(nèi)環(huán)境中所產(chǎn)生藥理效應(yīng)，其原有藥物成分或可在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成為藥物的活性成分，或這經(jīng)代謝后失活，也可能經(jīng)第二信使而發(fā)揮間接作用，所有這些均可通過(guò)血清藥理學(xué)研究所反映出來(lái)，從而使理論上更具科學(xué)性和真實(shí)性［27-28］。本次研究成功地從SD大鼠中提取并制備疏肝健脾含藥血清，并對(duì)LPS刺激大鼠體外肝細(xì)胞、Kup ffer細(xì)胞造成的炎癥損傷進(jìn)行含藥血清干預(yù)，結(jié)果表明，疏肝健脾組大鼠肝細(xì)胞及Kupffer細(xì)胞狀態(tài)與正常血清組無(wú)顯著差異，并且疏肝健脾組IL-1、SSA炎癥介質(zhì)釋放也較LPS組顯著減少，同時(shí)疏肝健脾含藥血清對(duì)肝細(xì)胞IκB蛋白、IKKβ磷酸化及Kupffer細(xì)胞NF-κB、IκB蛋白、IKKβ磷酸化蛋白的表達(dá)具有明顯的抑制作用。該結(jié)果提示：疏肝健脾含藥血清調(diào)控Kupffer細(xì)胞NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)及活化，減少炎癥介質(zhì) （IL-1，SSA）的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。

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：B

：1001-1528（2015）05-1114-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.044

2014-02-12

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 （30973694）；廣東省科技計(jì)劃資助項(xiàng)目 （2013B021800164）

韓 莉 （1963—），女，碩士，副主任醫(yī)師，從事中西醫(yī)結(jié)合肝病基礎(chǔ)與臨床研究。

*通信作者：楊欽河 （1961—），男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，從事中西醫(yī)結(jié)合肝病研究。E-mail：tyangqh@jnu.edu.cn