金匱腎氣丸溫補腎陽藥理作用的實驗研究

付正豐， 龔 明， 苗家偉， 岳秀永， 陳春梅， 嚴 磊， 陳 華*

（1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶404120；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016）

金匱腎氣丸溫補腎陽藥理作用的實驗研究

付正豐1， 龔 明1， 苗家偉1， 岳秀永1， 陳春梅1， 嚴 磊2， 陳 華1*

（1.重慶三峽醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶404120；2.重慶醫(yī)科大學(xué)，重慶400016）

目的以下丘腦-垂體-性腺軸為基礎(chǔ)，探究金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠的藥理作用，探討其溫補腎陽的作用機制。方法用氫化可的松建立腎陽虛模型大鼠，60只，隨機分為6組，造模后連續(xù)灌喂給藥30 d；分別于給藥第15天、第30天進行強迫負重游泳實驗；第30天，眼球取血，放射免疫分析法檢測血清睪酮 （T）、雌二醇 （E2）的水平；采用RT-PCR法檢測各組大鼠下丘腦、垂體和靶腺（睪丸）鈣調(diào)蛋白（CaM）mRNA的表達。結(jié)果與模型組比，金匱腎氣丸可明顯提高腎陽虛模型大鼠的負重游泳時長 （P＜0.05），給藥20 d后其體能趨于正常；金匱腎氣丸可明顯降低血清中雌二醇水平及升高睪酮水平 （P＜0.05）；金匱腎氣丸可明顯降低下丘腦、垂體、睪丸中CaMRNA的表達 （P＜0.05）。結(jié)論金匱腎氣丸具有明顯的溫補腎陽作用，可通過調(diào)節(jié)機體下丘腦-垂體-性腺軸中鈣調(diào)蛋白基因表達，改善腎陽虛大鼠激素水平，逆轉(zhuǎn)腎陽虛狀態(tài)。

金匱腎氣丸；下丘腦-垂體-性腺軸；雌二醇；睪酮；鈣調(diào)蛋白

金匱腎氣丸是中醫(yī)溫補腎陽的經(jīng)典基本方劑，常用于腎陽不足、腰膝酸冷、肢體浮腫、小便不利、生殖功能減退等腎陽虛衰證。研究發(fā)現(xiàn)，腎陽虛時細胞免疫、體液免疫、補體系統(tǒng)及網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞吞噬功能都有不同程度的降低，而通過補腎可獲得明顯提高，有效糾正機體免疫功能，使之恢復(fù)平衡的生理狀態(tài)。本研究以動物整體為對象，依托下丘腦-垂體-性腺軸對機體的調(diào)控作用進行研究，探討金匱腎氣丸溫補腎陽藥理作用的機制。

1 材料方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠，體質(zhì)量 （200±20）g，60只，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，動物合格證號SCXK（渝）2010-0001。

1.2 實驗儀器 Access2化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，美國Beckman公司生產(chǎn)；SN-69全自動雙探頭放射免疫γ計數(shù)儀，上海原子核研究所日環(huán)儀器一廠生產(chǎn)；10001-Series Thermal Cyclers PCR儀，美國BioRad公司生產(chǎn)；飛鴿TDL-40B型臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.3 實驗藥品與試劑 金匱腎氣丸 （水蜜丸）由北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠生產(chǎn)，規(guī)格為每100粒重 20 g，批準文號國藥準字 Z11020054，產(chǎn)品批號12030553。大鼠T（睪酮）放射免疫試劑盒及大鼠E2（雌二醇）放射免疫試劑盒，購自上海生工生物股份有限公司；TRIZOL RNA提取試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司；氫化可的松注射液，由吉林長白山藥業(yè)集團股份有限公司生產(chǎn)，批準文號國藥準字H22021471，產(chǎn)品批號20120301；甲基睪丸素片，由天津力生制藥股份有限公司生產(chǎn)，批準文號國藥準字 H12020153，產(chǎn)品批號12010618。

1.4 動物模型的建立及給藥 60只SD雄性大鼠隨機分為正常對照組、模型對照組、陽性藥物 （睪酮）組、金匱腎氣丸低、中、高劑量組，每組10只。除正常組注射生理鹽水外，其他各組大鼠每日中午右腿按25 mg/kg皮下注射氫化可的松，連續(xù)4 d，建立腎陽虛大鼠模型，隨后30 d內(nèi)給予氫化可的松，同時給予對應(yīng)的治療藥物：金匱腎氣丸低劑量 （0.5 g/kg）、中劑量 （1.0 g/kg）、高劑量 （2.5 g/kg）；陽性藥物組 （甲基睪酮片）（0.5 g/kg）。將各組藥物以5‰的CMC水溶液配制為10 mL/kg的給藥劑量，灌胃給藥，2次/d，連續(xù)治療30 d。

1.5 負重游泳實驗 所有大鼠于實驗前進行一次游泳訓(xùn)練，其后在接受藥物治療的第15天、第30天進行負重游泳實驗，尾部上三分之一處負其體質(zhì)量10%的鉛線記錄大鼠游泳力竭時間。力竭標準為大鼠全部身體沉入水下5秒不能浮出水面。

1.6 大鼠血清激素水平的檢測 第30日晚灌胃給藥后，禁食12 h。眼球取血，約3.5mL，斷頭處死后迅速取下丘腦、垂體、性腺 （睪丸）稱定質(zhì)量，置液氮中固定，后轉(zhuǎn)入-80℃低溫冰箱保存，用于基因檢測。血清采用SN-69全自動雙探頭放射免疫γ計數(shù)儀，按試劑盒操作說明檢測大鼠血清E2、T水平。

1.7 大鼠下丘腦-垂體-性腺軸鈣調(diào)蛋白的基因表達檢測

引物設(shè)計，從GeneBank中查出大鼠CaM基因和β-actin的mRNA序列，利用美國PE公司引物設(shè)計軟件Primer Express設(shè)計轉(zhuǎn)移性引物，大鼠CaM正向引物5＇-GAT AAG GAC GGC AATGGC TAC A-3＇；反向引物5＇-CGA TGTCTG CTTCCC TGA TCA T-3＇。擴增片段為115 bp。β-actin（內(nèi)參對照）正向引物5＇-CCT GTG GCA TCC ATG AAA CTA C-3＇；反向引物5＇-CTTCTGCATCCTGTC AGCGAT-3＇。擴增片段為134 bp。

取凍存組織 （下丘腦、垂體、睪丸）約10 mg，組織勻漿后按TRIZOL試劑盒說明書操作，提取總RNA。

逆轉(zhuǎn)錄：cDNA的合成，在50μL取2μL RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（TaqMan Buffer 5μL，1.25 u/μL Reverse Transcritase 1.25μL，0.4 u/μL Rnase Inhibitor 1μL，dNTP mixture 10μL，5.5 mmoL/L MgCL211μL，2.5μmoL/L Oligod 2.5μL，總RNA 5μL）中。震蕩混勻，于25℃孵育10min，48℃逆轉(zhuǎn)錄30min，95℃逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)滅火5min。

PCR擴增：取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物5μL，加入20μL擴增反應(yīng)體系（SYBR PCR Buffer 2.5μL，MgCl23μL，dNTPmixture 2μL，AmpliTaq Gold 0.125μL，各上下游引物0.5μL）中，95℃，變性5min，50℃退火2min，72℃延伸5min，進行36個循環(huán)。PCR產(chǎn)物分析，根據(jù)各組PCR產(chǎn)物的Ct值，計算每一樣品和其內(nèi)參對照相應(yīng)含量。1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 實驗數(shù)據(jù)均以x±s表示，分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠強迫游泳時間的影響 與正常組比較，模型組強迫游泳時間明顯縮短 （P＜0.05）；治療15 d，與模型對照組比較，陽性藥物組及金匱腎氣丸中、高劑量組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。治療30 d，與模型對照組比較，金匱腎氣丸低、中劑量組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），金匱腎氣丸高劑量組有明顯差異（P＜0.01）；金匱腎氣丸高劑量組與陽性藥物組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。見表1。

表1 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠強迫游泳時間的影響 （x± s，n=10）

2.2 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠血清激素水平的影響 模型對照組血清中 E2激素水平明顯高于正常對照組 （P＜0.01）。金匱腎氣丸低、中劑量組血清中E2激素水平低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），高劑量組明顯低于模型對照組 （P＜0.01）。同時模型對照組中血清T水平明顯低于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.01）。金匱腎氣丸低劑量組血清中T水平高于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05），中、高劑量組明顯高于模型對照組 （P＜0.01）。見表2。

表2 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠血清激素水平的影響 （x± s，n=10）

2.3 金匱腎氣丸對下丘腦-垂體-性腺軸CaMmRNA的表達

模型對照組下丘腦組織CaMmRNA的表達明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。金匱腎氣丸中、高劑量組下丘腦組織CaMmRNA的表達明顯降低，與模型對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。見表3。

表3 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠下丘腦CaMMRNA表達的影響（x±s，n=10）

模型對照組垂體組織CaMmRNA的表達明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。模型對照組與陽性藥物組、金匱腎氣丸低、中劑量組比較CaMmRNA的表達無明顯差異 （P＞0.05）。金匱腎氣丸高劑量組垂體組織CaMmRNA的表達與模型對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠垂體CaMMRNA表達的影響（x±s，n=10）

模型對照組睪丸組織CaMmRNA的表達明顯高于正常對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。金匱腎氣丸中、高劑量組睪丸組織CaMmRNA的表達明顯低于模型對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。見表5。

表5 金匱腎氣丸對腎陽虛大鼠睪丸CaMMRNA表達的影響（x±s，n=10）

3 討論

中醫(yī)認為，腎為先天之本，五臟陽氣之根［1］。中醫(yī)學(xué)所講的 “腎”的概念，非現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中單純的解剖學(xué)概念，是由腎、命門、膀胱、骨髓、耳竅、二陰及其所屬的經(jīng)絡(luò)共同組成的 “腎系統(tǒng)”。中醫(yī)學(xué)中所論述的 “腎藏精”、“主骨生髓”、“腎主水”、“腎主納氣”等腎的功能，實指整個 “腎系統(tǒng)”的功能，是神經(jīng)、內(nèi)分泌、泌尿、生殖等一系列相關(guān)生理功能的概括。對于腎陽虛的大量實驗研究表明，運用氫化可的松建立腎陽虛模型是較為經(jīng)典的造模方法，符合中醫(yī)的證［2］。腎陽虛的動物會出現(xiàn)一些未老先衰的癥狀如體質(zhì)量下降、耐力低下、性能力減弱、精神萎靡不振、反應(yīng)遲鈍等一系列癥狀［3］。金匱腎氣丸主要由熟地、山藥、山茱萸 （酒炙）、茯苓、牡丹皮、澤瀉、桂枝、附子 （制）組成，輔料為蜂蜜，具有溫補腎陽、化氣行水之功效。方中熟地滋腎填精，山茱萸補肝脾而益精血，山藥健脾補虛，滋精固腎，澤瀉清泄腎火，牡丹皮瀉陰中之火，使火退而陰生，并能制約山茱萸的溫燥性，茯苓淡滲脾濕，與澤瀉相配以行腎邪，助山藥健脾益精，附子、桂枝益精血助命門，以溫陽化氣，引火歸元。諸藥協(xié)同，可調(diào)整腎肝脾三臟功能，有開有闔，寓瀉于補，使補而不膩，瀉邪而不傷正。

神經(jīng)體液調(diào)節(jié)是機體保持自身穩(wěn)定、糾正病態(tài)的最重要的調(diào)節(jié)性體系之一。主要有下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸、性腺軸及甲狀腺軸三組。研究表明，腎陽虛證的病人常出現(xiàn)上述三軸不同環(huán)節(jié)不同程度的功能紊亂［4-5］，并累及性腺軸、甲狀腺軸［6-7］，涉及神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)等諸系統(tǒng)組織器官多功能的變化，是多器官與多系統(tǒng)相互作用影響的綜合表現(xiàn)［8］。其中下丘腦-垂體-性腺軸功能的異常改變直接影響著機體神經(jīng)、內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)，因此逆轉(zhuǎn)其功能紊亂的狀態(tài)，可以從根本上調(diào)節(jié)血清中激素如雌二醇、睪酮等的表達，從而影響腎上腺皮質(zhì)、垂體、甲狀腺、性腺等器官的組織形態(tài)，使其功能相互協(xié)調(diào)［9］。CaM（鈣調(diào)蛋白）是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，主要分布與腦及內(nèi)分泌器官，并對下丘腦-垂體-性腺軸的分泌功能密切相關(guān)。CaM可以作用于下丘腦-垂體-性腺軸的不同環(huán)節(jié)、不同層次，直接導(dǎo)致不同激素的改變，因而CaMmRNA在各個器官、組織中的協(xié)調(diào)表達對機體神經(jīng)內(nèi)分泌作用具有明顯的調(diào)控作用［10］。

本研究顯示：金匱腎氣丸可明顯改善腎陽虛大鼠的體能狀態(tài)，且隨著給藥劑量及給藥時間的延長，其治療作用更加顯著。對腎陽虛大鼠血清中E2及T的激素水平的影響表明，金匱腎氣丸可調(diào)節(jié)機體激素水平，通過逆轉(zhuǎn)抑制性激素E2的水平，并刺激提升激素T的水平，綜合改善腎陽虛狀態(tài)，并且體內(nèi)狀態(tài)的改善程度與腎陽虛大鼠血清E2及T的激素水平的變化呈明顯的正相關(guān)性。金匱腎氣丸可增強下丘腦及睪丸CaMmRNA的表達，從而從整體上調(diào)控體內(nèi)激素的協(xié)調(diào)表達；對垂體CaMmRNA的表達僅在高劑量組有所表現(xiàn)，這也提示其作用較慢，可能有更為復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程。實驗結(jié)果表明：金匱腎氣丸可通過調(diào)節(jié)腎陽虛大鼠的下丘腦-垂體-性腺軸CaM的表達，調(diào)控腎陽虛大鼠E2及T激素水平的表達，改變病理狀態(tài)。但對于CaM介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及有效化學(xué)成分的相關(guān)性，有待進一步的研究。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1111-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.043

2014-11-15

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項目 （20121096）；重慶市高等教育教學(xué)改革研究重點項目 （132128、133309）；萬州區(qū)科技計劃項目 （201203055）

付正豐 （1978—），男，碩士生，講師，主要從事中西醫(yī)臨床及中藥藥理學(xué)方面研究。Tel：13996539870，E-mail：fuzz06@ 126.com

*通信作者：陳 華 （1964—），男，副教授，主要從事中藥藥理學(xué)方面研究。Tel：（023）58556830，E-mail：mybestdorthy@ hotmail.com