肝癌復(fù)方對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞移植瘤的抑制作用初探

孫 瀚， 范雪梅， 王義明， 王佩瑤， 孟憲生， 梁瓊麟， 羅國(guó)安

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600；2.清華大學(xué)化學(xué)系，北京100084）

肝癌復(fù)方對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞移植瘤的抑制作用初探

孫 瀚1， 范雪梅2*， 王義明2， 王佩瑤1， 孟憲生1， 梁瓊麟2， 羅國(guó)安2*

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧大連116600；2.清華大學(xué)化學(xué)系，北京100084）

目的探討肝癌復(fù)方及其組方單味藥材對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞移植瘤的抑制作用。方法建立小鼠肝癌H22細(xì)胞移植瘤模型，造模小鼠隨機(jī)分組后干預(yù)給藥，考察給藥周期中小鼠體質(zhì)量的變化并測(cè)量移植瘤質(zhì)量，計(jì)算藥物抑瘤率。結(jié)果肝癌復(fù)方組小鼠體質(zhì)量變化最接近空白對(duì)照組，且肝癌復(fù)方的抑瘤效果最好，抑瘤率為53.85%，優(yōu)于本實(shí)驗(yàn)所選擇的兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照藥環(huán)磷酰胺和斑蝥的抑瘤率 （分別為48.46%和17.69%）。結(jié)論肝癌復(fù)方對(duì)小鼠肝癌移植瘤具有較好的抑制作用，且副作用較小。本研究可為肝癌復(fù)方臨床治療應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

肝癌復(fù)方；肝癌；H22細(xì)胞移植瘤模型；抑瘤率

肝癌是世界上常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，高居惡性腫瘤排名榜的第五位，且世界各地肝癌發(fā)病率均有上升趨勢(shì)［1-2］。肝癌是高度惡性、預(yù)后極差的腫瘤之一，未經(jīng)治療，一般生存期僅為1～4個(gè)月［3-4］。

肝癌復(fù)方是根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)藥臨床經(jīng)驗(yàn)，由水紅花子、花蕊石、白茅根、薏苡仁四味中藥組成的經(jīng)驗(yàn)方，其中水紅花子為君藥。該方具有止痛止血、疏經(jīng)通絡(luò)、健脾祛濕、破癥散結(jié)、祛瘀生新等功效，可舒緩肝癌患者臨床癥狀，甚至減小腫瘤體積。因此本研究建立了小鼠肝癌H22細(xì)胞實(shí)體瘤移植模型，考察肝癌復(fù)方對(duì)肝癌的治療作用。

1 材料及設(shè)備

1.1 細(xì)胞株及動(dòng)物 小鼠肝癌H22細(xì)胞株，購(gòu)自上海復(fù)蒙基因生物科技有限公司。雌性SPF級(jí)昆明種小鼠130只，體質(zhì)量18～22 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2006-0009，于清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)中心三層屏障環(huán)境小鼠IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)飼養(yǎng)。1.2 藥物 水紅花子藥材（產(chǎn)地廣西，生產(chǎn)批號(hào)090901），薏苡仁藥材（產(chǎn)地貴州，批號(hào)20090801），購(gòu)自大連經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)保健大藥房；花蕊石藥材 （產(chǎn)地廣西，生產(chǎn)批號(hào)080201），購(gòu)自亳州市中藥飲片廠；白茅根藥材 （產(chǎn)地河北，批號(hào)20070601），購(gòu)自大連市同仁堂藥店；肝癌復(fù)方由上述藥材組合經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室加工而成；環(huán)磷酰胺注射劑（生產(chǎn)批號(hào)10042521），復(fù)方斑蝥膠囊（生產(chǎn)批號(hào)100805），購(gòu)自北京腫瘤醫(yī)院。

1.3 試劑及儀器 臺(tái)盼藍(lán)染料 （北京索萊寶科技有限公司，中國(guó)）；DMEM，胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)），DMSO（Amresco公司，美國(guó)）。超純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國(guó)）；MCO-15AC二氧化碳培養(yǎng)箱（Sanyo公司，日本）；XDS-1B/XJP-6A相差顯微鏡（Olympus公司，日本）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Hettich公司，德國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 肝癌H22細(xì)胞小鼠腹水模型建立［5-7］取健康狀態(tài)良好，已飼養(yǎng)3 d的SPF級(jí)昆明小鼠10只，于SPF級(jí)動(dòng)物無(wú)菌操作平臺(tái)中，無(wú)菌吸取肝癌H22細(xì)胞懸液0.2 mL，注射于小鼠腹腔。原代肝癌H22細(xì)胞小鼠接種后約7 d至10 d內(nèi)可觀察到腹部膨大，說(shuō)明接種成功。無(wú)菌吸取接種7 d的小鼠肝癌H22細(xì)胞腹水混懸液，以無(wú)菌生理鹽水按照1∶3比例稀釋，另取SPF級(jí)昆明種小鼠，無(wú)菌吸取0.2 mL稀釋后的肝癌H22細(xì)胞懸液注射入小鼠腹腔，進(jìn)行傳代。

2.2 小鼠肝癌H22細(xì)胞實(shí)體瘤模型的建立

2.2.1 肝癌H22細(xì)胞混懸液的制備及腋下移植瘤接種 傳代3次，接種7 d，腹水長(zhǎng)勢(shì)良好的昆明小鼠，脫頸椎處死，利用碘酒、醫(yī)用酒精對(duì)小鼠腹部皮膚進(jìn)行消毒，無(wú)菌抽取腹水。臺(tái)盼藍(lán)染料對(duì)腹水中肝癌H22細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)和計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率應(yīng)大于95%，計(jì)算腹水中細(xì)胞密度。以生理鹽水稀釋腹水，使細(xì)胞密度維持在1.0×107個(gè)/mL左右。隨機(jī)選取10只小鼠作為空白組，對(duì)其余80只健康SPF級(jí)雌性昆明小鼠進(jìn)行腋下移植瘤接種。碘酒、醫(yī)用酒精消毒小鼠右腋下皮膚，牙科手術(shù)鑷子提起小鼠右腋下皮膚，將0.2 mL稀釋后的腹水溶液注射于小鼠右腋皮下，保證無(wú)腹水溶液滲出。

2.2.2 小鼠的分組、給藥與飼養(yǎng) 小鼠接種腋下移植瘤后24 h，將80只接種昆明小鼠隨機(jī)分成8組：模型組、西藥陽(yáng)性對(duì)照環(huán)磷酰胺組（2.000 mg/mL）、中藥陽(yáng)性對(duì)照斑蝥組（0.008 mg/mL）、肝癌復(fù)方組、水紅花子組、薏苡仁組、花蕊石組、白茅根組，肝癌復(fù)方及其單味藥均為40.909mg/mL，每組10只，另有10只空白組小鼠。9組小鼠每天定時(shí)灌胃給藥，灌胃劑量為0.5 mL，每日2次，連續(xù)給藥10 d。藥物均用1μL/mLCMC-Na溶液溶解，空白對(duì)照組及模型組每次灌胃CMC-Na溶液。分別于給藥后第3天、第6天、第10天稱量小鼠體質(zhì)量，監(jiān)測(cè)其變化。

2.3 樣本采集及指標(biāo)測(cè)定 給藥第9天禁食不禁水，次日，稱量小鼠體質(zhì)量，脫頸椎處死小鼠。用牙科手術(shù)鑷子鑷住小鼠右腋下腫瘤生長(zhǎng)部位皮膚，以手術(shù)剪刀剪開(kāi)小鼠皮膚，使移植瘤暴露出來(lái)，以牙科手術(shù)鑷鈍性剝離移植瘤。用生理鹽水清洗瘤組織3次以除盡組織中的血液并采用濾紙吸去多余生理鹽水，稱量移植瘤質(zhì)量，記錄瘤質(zhì)量。按如下公式計(jì)算各給藥組的抑瘤率，采用SPSS軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)組間是否存在顯著性差異。

各組抑制率 （%）=［1-（給藥組平均瘤質(zhì)量/模型組平均瘤質(zhì)量）］×100%

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 給藥期間各組小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì) 小鼠體質(zhì)量變化可以部分反映瘤質(zhì)量的大小和藥物副作用的大小，各組小鼠在給藥第0天、給藥第3天、給藥第6天、給藥第10天的體質(zhì)量變化趨勢(shì)如圖1所示。各組小鼠在給藥第0天到第6天體質(zhì)量增長(zhǎng)迅速，給藥第6天到第10天體質(zhì)量增長(zhǎng)速度趨緩，甚至略微下降，處于體質(zhì)量平衡期。其中肝癌復(fù)方組和花蕊石組在給藥第6天到第10天體質(zhì)量最接近空白對(duì)照組，說(shuō)明其對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響較小。

圖1 各組小鼠給藥期間體質(zhì)量變化趨勢(shì)圖

3.2 各組藥物對(duì)小鼠移植瘤的抑制作用 各組小鼠實(shí)驗(yàn)前后體質(zhì)量、瘤質(zhì)量和抑瘤率如表1所示，與模型組相比，環(huán)磷酰胺組、肝癌復(fù)方組、水紅花子組、白茅根組、花蕊石組小鼠的抑瘤率顯著降低，說(shuō)明上述5種藥物對(duì)小鼠肝癌移植瘤具有抑制作用。肝癌復(fù)方的抑瘤作用最佳，抑瘤率達(dá)到53.85%，其次為肝癌復(fù)方中的君藥水紅花子，抑瘤率為49.23%。

4 討論

復(fù)方因其與組方單味藥相比具有增效減毒的優(yōu)點(diǎn)，不僅是中藥用藥的主要形式［8-9］，也逐步被西方所接受。本研究建立小鼠肝癌H22細(xì)胞實(shí)體瘤移植模型，考察了肝癌復(fù)方及其組成單味藥物對(duì)小鼠體質(zhì)量及瘤質(zhì)量的影響。

通過(guò)各組小鼠給藥期間體質(zhì)量變化趨勢(shì)，發(fā)現(xiàn)小鼠體質(zhì)量的增加可能與瘤質(zhì)量的增加相關(guān)，肝癌復(fù)方組在給藥第6天到第10天體質(zhì)量最接近空白對(duì)照組，說(shuō)明肝癌復(fù)方對(duì)移植瘤產(chǎn)生抑制作用較好?；ㄈ锸M的小鼠在給藥第6天到第10天體質(zhì)量出現(xiàn)小幅下降，可能由于花蕊石為礦物類藥材，含有鎘 （Cr）、砷 （As）等有毒重金屬元素較多［10］、毒性較強(qiáng)，導(dǎo)致小鼠體質(zhì)量下降。而白茅根組的小鼠體質(zhì)量在這一時(shí)期卻呈現(xiàn)小幅度上升趨勢(shì)，推測(cè)除瘤質(zhì)量增加外，白茅根藥材中的有效組分為白茅根多糖類成分，具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用［11］并能為小鼠提供營(yíng)養(yǎng)，也可使該組小鼠體質(zhì)量增加。另外，環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量變化趨勢(shì)有別于其他各組小鼠，且該組小鼠各段時(shí)期平均體質(zhì)量均低于其他各組小鼠。推測(cè)其原因可能為環(huán)磷酰胺為烷化劑類抗腫瘤藥物可通過(guò)干擾所有快速增生組織的細(xì)胞分裂而達(dá)到抑制惡性腫瘤的目的，但有較多文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)磷酰胺具有較強(qiáng)的心臟毒性［12］。有研究表明［7］環(huán)磷酰胺可能引起肝臟巰基和細(xì)胞色素P450含有量下降而導(dǎo)致肝臟毒性，推測(cè)由于環(huán)磷酰胺的較強(qiáng)毒性導(dǎo)致環(huán)磷酰胺組小鼠體質(zhì)量低于其他各組，且其體質(zhì)量變化趨勢(shì)有別于其他各組小鼠。肝癌復(fù)方組小鼠體質(zhì)量最接近空白組，說(shuō)明其對(duì)小鼠的生長(zhǎng)的影響最小。

表1 各組藥物抑瘤率 （x±s，n=10）

從各給藥組抑瘤率來(lái)看，肝癌復(fù)方抑瘤率高于臨床證明有較好肝癌治療作用的兩個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組 （環(huán)磷酰胺組、斑蝥組）抑瘤率，說(shuō)明肝癌復(fù)方對(duì)小鼠肝癌移植瘤具有較好的治療作用。肝癌復(fù)方的抑瘤率高于其君藥水紅花子組，從增效性角度證明了中藥復(fù)方配伍的必要性。水紅花子組的抑瘤率高于其他各單味藥組 （薏苡仁組、白茅根組、花蕊石組），從藥理角度證明了水紅花子在肝癌復(fù)方中的君藥地位。

綜上所述，肝癌復(fù)方可有效抑制小鼠肝癌細(xì)胞移植瘤，且副作用小。本研究可為肝癌復(fù)方后續(xù)深入研究及臨床應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Liu Y，Chang C CH，Marsh G M，et al.Population attributable risk of aflatoxin-related liver cancer：systematic review and meta-analysis［J］.Eu JCancer，2012，48（14）：2125-2136.

［2］Chen JG，Zhang SW.Liver cancer epidemic in China：past，present and future［C］//Seminars in cancer biology.Academic Press，2011，21（1）：59-69.

［3］羅榮城，陳逢生.肝癌2009年臨床研究進(jìn)展與展望［J］.中國(guó)處方藥，2010，94（1）：47-51.

［4］周立新.肝癌靶向藥物治療的研究進(jìn)展［J］.腫瘤學(xué)雜志，2009，15（2）：156-161.

［5］王 晶，偉忠民.秦皮乙素誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞SMMC-7721凋亡的機(jī)制研究［J］.中成藥，2012，34（11）：2059-2063.

［6］畢 芳，陶文沂，陸震鳴.白首烏提取物對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞H-（22）的抑制作用［J］.中成藥，2007，29（11）：1586-1590.

［7］趙婷秀，陳振發(fā).中藥血清藥理學(xué)方法的研究現(xiàn)狀［J］.湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，5（3）：45-46.

［8］羅國(guó)安，梁瓊麟，劉清飛，等.復(fù)方藥物研發(fā)創(chuàng)新體系展望［J］.世界科學(xué)技術(shù) （中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2009，11（1）：3-10.

［9］梁瓊麟，羅國(guó)安，鄒健強(qiáng)，等.中藥復(fù)方新藥創(chuàng)制及技術(shù)支撐體系［J］.世界科學(xué)技術(shù) （中醫(yī)藥現(xiàn)代化），2008，10（3）：1-7.

［10］趙 晶，孟憲生，包永睿，等.花蕊石煅制后結(jié)構(gòu)變化與元素溶出量差異研究［J］.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010，29（5）：565-568.

［11］呂世靜，黃槐蓮，袁漢堯，等.白茅根多糖對(duì)人T淋巴細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的研究［J］.中國(guó)新藥雜志，2004，13（9）：834-835.

［12］顧穎莉，朱漢威.環(huán)磷酰胺心臟毒性作用的研究進(jìn)展［J］.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，24（9）：772-774.

R285.5

：B

：1001-1528（2015）05-1091-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.037

2014-11-19

孫 瀚（1989—），男，碩士生，研究方向?yàn)橹兴帉W(xué)。Tel：18651535403，E-mail：sun.vic@foxmail.com

*通信作者：范雪梅（1981—），女，博士，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)橹兴幩幚?。Tel：（010）62781688，E-mail：xuemeifan@tsinghua.edu.cn羅國(guó)安（1946—），男，教授，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥系統(tǒng)生物學(xué)。Tel：（010）62772264，E-mail：luoga@tsinghua.edu.cn