醋炙對甘遂3種三萜類成分的影響及腸上皮細(xì)胞的毒性

王文曉， 楊艷菁， 曹亮亮， 張 麗， 丁安偉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇南京210023）

醋炙對甘遂3種三萜類成分的影響及腸上皮細(xì)胞的毒性

王文曉， 楊艷菁， 曹亮亮， 張 麗*， 丁安偉

（南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心/中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇南京210023）

目的研究甘遂醋炙前后3種三萜類成分（大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol）含有量變化及其對腸上皮細(xì)胞的毒性。方法采用HPLC法分別在210、255、270 nm測定甘遂和醋甘遂飲片中該3種成分的量。采用MTT法檢測3種成分對大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞IEC-6細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果醋炙后大戟二烯醇、kansenone、11-oxokansenonol含有量均降低，降低率分別為13.43%、15.15%、14.79%。對IEC-6細(xì)胞的IC50分別為71.41、15.27和14.53μmol/L。結(jié)論甘遂醋炙后3種三萜類成分含有量的降低與醋炙減毒有一定的相關(guān)性。

甘遂；醋炙；IEC-6；大戟二烯醇；kansenone；11-oxo-kansenonol

甘遂為大戟科大戟屬植物甘遂Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang的干燥塊根，味苦，性寒，有毒，素有峻下逐水圣藥之稱［1］。但甘遂強(qiáng)烈的皮膚刺激性，嚴(yán)重的肝臟、胃腸道毒性以及促炎、誘發(fā)腫瘤等毒性［2］，嚴(yán)重制約了其臨床的安全應(yīng)用。歷代中醫(yī)采用醋制法降低甘遂的毒性和刺激性，緩和其瀉下作用。研究表明，甘遂的毒性成分主要集中在石油醚和乙酸乙酯部位中的二萜與三萜類成分［3-4］。然而既往甘遂醋炙減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)報道多集中在甘遂中二萜類成分毒性方面，較少涉及甘遂中三萜類化合物的毒性以及與醋炙減毒相關(guān)性的研究［5-7］。因此，本實驗擬以大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞 （IEC-6）為研究對象，探討甘遂中大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol這3種三萜類成分對腸上皮細(xì)胞的毒性并比較醋炙前后該3種成分的含有量變化，為進(jìn)一步闡明甘遂醋炙減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀（美國Waters公司）、Waters 2996 PDA檢測器、BP211D型電子天平（精確到0.01 mg）、SW-CJ-1FD超凈工作臺 （蘇州凈化設(shè)備有限公司）、CO2恒溫培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）、倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、powerwave X340全波長酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）。

1.2 試劑 甲醇 （色譜純，江蘇漢邦科技有限公司），乙腈 （色譜純，美國Tedia公司），水為重蒸水，DMEM高糖培養(yǎng)基干粉（Gibco，賽默飛世爾科技有限公司），胎牛血清 （維森特生物技術(shù)有限公司，批號085-150），磷酸緩沖鹽 （PBS，博士微生物工程有限公司，批號 AR0030），胰蛋白酶（韓國Bio-sharp公司，批號27250-018），MTT（北京索萊寶科技有限公司，批號M8180）。

1.3 實驗材料

1.3.1 藥材 甘遂藥材購自陜西寶雞赤沙鄉(xiāng)，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)王春根教授鑒定為大戟科Euphorbiaceae植物甘遂Euphorbia kansui T.N.Liou ex T. P.Wang的干燥塊根，批號20131008。取生甘遂，大小分檔，除去雜質(zhì)，即為甘遂生品。取凈甘遂，照 《中國藥典》2010年版一部醋炙法 （附錄ⅡD）加醋拌勻，悶透，待醋被吸盡后，將炒鍋加熱到260℃左右，不斷翻炒，9 min后出鍋，放涼，即為甘遂醋炙品。每100 kg甘遂用醋30 kg。顏色加深，略有焦斑。

1.3.2 對照品 大戟二烯醇、kansenone、11-oxokansenonol為實驗室自制，經(jīng)HPLC法檢測，純度均大于98%?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

1.3.3 細(xì)胞 大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞株IEC-6（購自ATCC細(xì)胞庫）。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘遂醋炙前后三萜類成分變化

2.1.1 供試品溶液的制備 分別稱取生甘遂、醋甘遂粉末 （過4號篩）各0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取 （功率250 W，頻率50 kHz）30 min，放冷，密塞再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 成分化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of coMpounds

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol對照品適量，加甲醇制成分別為1.082、0.894、1.100 mg/ML的對照品貯備液。取各對照品貯備液適量，制成含大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol分別為259.6、14.31、13.20μg/mL的1號混合對照品溶液。

2.1.3 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相為水（A）-乙腈 （B），梯度洗脫 （0～13 min，50%～20% A；13～19 min，20%～15%A；19～22 min，15%～10%A；22～30 min，10%A；30～35 min，10%～50%A）。體積流量1.0 mL/min；檢測波長210 nm（大戟二烯醇）、255 nm（kansenone）、270 nm（11-oxo-kansenonol）；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL。此條件下樣品中大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol與其他成分可達(dá)到基線分離。見圖2。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 線性關(guān)系考察 精密量取1號混合對照品溶液5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得2號混合對照品溶液，同法，采用逐步稀釋法，分別制得3～6號混合對照品溶液。按“2.1.3”項下色譜條件，精密吸取上述各對照品溶液20μL注入高效液相色譜儀，每份溶液平行進(jìn)樣2次。按標(biāo)準(zhǔn)曲線法以峰面積計算，以各對照品峰面積平均值為縱坐標(biāo) （Y），對照品質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo) （X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得各成分回歸方程為：大戟二烯醇Y=231 828.110X-611 120.995 0（r=0.999 3）；kansenone Y= 13 397.678X+714.039 8（r=0.999 6）；11-oxo-kansenonol Y=4 444.400 X+251.422 9（r= 0.999 6）。表明大戟二烯醇、kansenone、11-oxokansenonol的進(jìn)樣量分別在0.162～5.192μg，0.009～0.282μg，0.008 3～0.264μg之間呈良好的線性關(guān)系。

圖2 甘遂醋炙前后HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograMs of Kansui Radix before and after beging p rocessed w ith vinegar

2.1.4.2 精密度試驗 在上述色譜條件下，以4號混合對照品溶液為考察對象，依法測定，連續(xù)進(jìn)樣6次，得大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol峰面積的RSD分別為0.8%、1.0%、1.1%。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批甘遂生品6份，均依法處理并進(jìn)行測定。計算得大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol的RSD分別為1.1%、1.3%、1.8%。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h進(jìn)樣20μL，測定峰面積，計算得大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol峰面積的RSD分別為1.1%、0.9%、1.4%。

2.1.4.5 加樣回收率試驗 取已知含有量的甘遂生品粉末約0.1 g，共6份，精密稱定。分別加入各對照品適量，按 “2.1.1”項下方法制備供試品溶液，依法測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1。2.1.5 樣品測定 分別取甘遂、醋甘遂粉末約0.2 g，精密稱定，按 “2.1.1”項下方法制備供試品溶液，依法測定，每份溶液連續(xù)進(jìn)樣2次。以峰面積平均值按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算各供試品樣品中大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol的量，變化率計算公式為：（生品平均值-醋品平均值）/生品平均值×100%。結(jié)果見表2。

表1 加樣回收試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

表2 甘遂炮制前后成分測定結(jié)果 （n=6）Tab.2 Results of quantitative deterMination of Kansui Radix before and after beging processed（n=6）

2.2 對腸上皮細(xì)胞的毒性實驗

2.2.1 供試品的制備 取大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol適量，精確稱定，加DMSO溶解制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的樣品貯備液，以0.22μm濾器推濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。實驗時以DMEM培養(yǎng)液稀釋至所需質(zhì)量濃度（C1～C5），其中大戟二烯醇質(zhì)量濃度 （C1～C5）分別為1.5、3.0、6.0、12.0、24.0μg/mL；kansenone和11-oxo-kansenonol的質(zhì)量濃度（C1～C5）分別為0.75、1.5、3.0、6.0、12.0μg/mL。

2.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) IEC-6細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃，5% CO2的飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于本實驗。

2.2.3 MTT法測定大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol對IEC-6細(xì)胞相對增殖抑制率（IC50） 取對數(shù)生長期的IEC-6細(xì)胞，用含0.03%EDTA-0.25%胰蛋白酶液消化，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個/mL，每孔100 mL接種于96孔板中，置于37℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。孵育24 h后，輕輕吸棄上清，隨機(jī)分為空白對照組、大戟二烯醇給藥組、kansenone給藥組、11-oxo-kansenonol給藥組。各給藥組分別加入100 mL不同質(zhì)量濃度 （C1～C5）的供試品溶液，每個質(zhì)量濃度設(shè)6復(fù)孔?？瞻讓φ战M加入等體積的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃，5%CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，每孔加入新鮮配制的5 mg/mL的MTT溶液20μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕吸棄上清，每孔加入DMSO溶液150μL，水平搖床混勻后，酶標(biāo)儀于 490 nm波長處測定吸光度（A）。按下式計算甘遂各供試品對IEC-6細(xì)胞增殖的相對抑制率 （IR）。

IR%=（1-A給藥組均值/A空白對照組均值）×100%

2.2.4 數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，各組定量檢測數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間比較采用LSD檢驗。

2.2.5 實驗結(jié)果 實驗結(jié)果表明，kansenone、11-oxo-kansenonol對IEC-6均有較強(qiáng)的增殖抑制作用，且隨濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)。大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol對IEC-6細(xì)胞的IC50分別為71.41、15.27、14.53μmol/L。實驗結(jié)果見圖5。

圖5 大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol對IEC-6細(xì)胞增殖的影響（n=6）Fig.5 Dose-dependen t inhibition effects of euphol，kansenone and 11-oxo-kansenonol on IEC-6 cell proliferation（n=6）

3 討論

腸黏膜屏障具有保護(hù)胃腸黏膜免受酸、堿、酶、細(xì)菌和毒素等腸道內(nèi)容物損傷的作用［8］。但在創(chuàng)傷、應(yīng)激等情況下，其結(jié)構(gòu)和功能可受到嚴(yán)重?fù)p害，從而引起一系列病理生理的變化［9］。隱窩細(xì)胞的增殖是腸黏膜病理性損傷后，修復(fù)重建上皮完整性和維護(hù)黏膜屏障的關(guān)鍵［8］。由于甘遂的毒性主要表現(xiàn)在胃腸道部位，故本實驗采用腸上皮細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)的研究。大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞（IEC-6）保持了小腸上皮干細(xì)胞未分化的特性，與增殖性隱窩細(xì)胞沒有明顯差別［10］，其廣泛用于研究小腸上皮細(xì)胞的生長、分化、代謝等功能，藥物作用以及各種致病因素作用下的腸黏膜的病理生理改變及其發(fā)病機(jī)制等，是研究和檢查黏膜愈合、細(xì)胞增殖反應(yīng)等較合適的體外模型［11-12］。

《中國藥典》2010年版甘遂含量測定項下采用C8柱、乙腈-水 （95∶5）、檢測波長210 nm測定甘遂中大戟二烯醇的量，因kansenone、11-oxokansenonol與大戟二烯醇具有相同的母核，極性較小，宜采用C8柱，且均具有共軛結(jié)構(gòu)，在紫外下有較強(qiáng)吸收，故本實驗采用高效液相色譜-多波長檢測法，根據(jù)3個成分的最大吸收波長，在C8色譜柱上同時檢測大戟二烯醇（210 nm）、kansenone（255 nm）和11-oxo-kansenonol（270 nm）。

本實驗室前期研究表明，乙酸乙酯部位為甘遂的毒性部位，而大戟二烯醇、kansenone、11-oxokansenonol 3種成分均由乙酸乙酯部位分離純化得到［13］。本實驗結(jié)果表明醋炙后3種成分的含有量均有一定程度的降低，分析其原因可能是由于在醋炙過程中經(jīng)歷酸性高溫的環(huán)境后，引發(fā)了氧化、水解或重排等反應(yīng)，導(dǎo)致含有量改變和結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，甘遂醋炙后其乙酸乙酯部位對小鼠腸損傷明顯低于醋炙前，本實驗中亦觀察到kansenone、11-oxo-kansenonol對IEC-6細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，且呈濃度依賴性。由此，推測甘遂經(jīng)醋炙后對IEC-6細(xì)胞的減毒效應(yīng)可能與其醋炙后大戟二烯醇、kansenone、11-oxo-kansenonol等3種成分的減少有關(guān)，為進(jìn)一步探討醋炙減毒物質(zhì)基礎(chǔ)提供了依據(jù)。但本實驗所用藥材飲片僅為主產(chǎn)地一批，且主要研究了三萜類毒性代表性物質(zhì)炮制前后的含有量變化，因此，后續(xù)將對多產(chǎn)地多批次的藥材以及炮制后化學(xué)成分的轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物毒性評價做進(jìn)一步研究。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：81.

［2］鄭維發(fā).甘遂醇提物中4種二萜類化合物的體內(nèi)抗病毒活性研究［J］.中草藥，2004，35（1）：65.

［3］耿 婷，黃海燕，丁安偉，等.甘遂炮制前后各部位刺激性和瀉下作用研究［J］.中南藥學(xué)，2008，6（4）：385-388.

［4］曹雨誕，張 麗，李 媛，等.甘遂的毒性成分、炮制方法及炮制減毒機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國藥房，2011，22（19）：1817-1818.

［5］顏曉靜，張 麗，李 璘，等.醋制降低甘遂對人正常肝細(xì)胞毒性研究［J］.中國中藥雜志，2012，37（11）：1667-1671.

［6］李征軍，李 媛，高 蘭，等.甘遂不同炮制品中二萜類成分的變化研究［J］.中成藥，2011，33（12）：2121-2125.

［7］Zhang L，Gao L，Li Z J，etal.Bio-guided isolation of the cytotoxic terpenoids froMthe roots of Euphorbia kansui against human normal cell lines L-O2 and GES-1［J］.Int J Mol Sci，2012，13（9）：11247-11259.

［8］HiroshiM，Wu D C，Daniel K，et al.Impaired defense of intestinalmucosa in mice lacking intestinal trefoil factor［J］.Science，1996，274（5285）：262-265.

［9］石 剛，陳嘉勇，徐鵬遠(yuǎn).腸道粘膜屏障的損傷與保護(hù)［J］.腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)，2004，11（1）：61-63.

［10］Quaroni A，Wands J，Trelstad R L，et al.Epithelioid cell cultures froMrat small intestine.Characterization by morphologic and immunologic criteria［J］.J Cell Biol，1979，80（2）：248-265.

［11］Carrol KM，Wong T T，Drabik D L，etal.Differentiation of rat small intestinalepithelial cells by extracellularmatrix［J］.AMJ Physiol，1988，254（3 Pt1）：G355-360.

［12］冉新澤，粟永萍，程天民.等.大鼠小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)體系的建立及其影響因素的探討［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，1997，7（5）：8-11.

［13］高 蘭，顏曉靜，李征軍，等.醋制降低甘遂對小鼠胃腸道氧化損傷作用機(jī)制研究［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（10）：257-260.

Triterpenes change of processing Kansui Radix w ith vinegar and their toxicity to intestinal epithelial cells

WANGWen-xiao， YANG Yan-jing， CAO Liang-liang， ZHANG Li*， DING An-wei
（Jiangsu Collaborative Innovation Center of ChineseMedicinal Resources Industrialization，and Nationaland Local Collaborative Engineering Center of ChineseMedicinal Resources Industrialization and Formulae InnovativeMedicine，Nanjing University of ChineseMedicine，Nanjing 210046，China）

AIMTo study the content changes of euphol，kansenone and 11-oxo-kansenonol froMKansui Radix before and after processingwith vinegar and their toxicity to intestinalepithelial cells.METHODSThe assay of triterpenes in processing Kansui Radix with vinegarwasmeasured at210 nm，255 nMand 270 nMby HPLC，respectively.The MTT assay wasemployed to examine the growth inhibition of IEC-6 cellswhich were pretreated with these triterpenes.RESULTSThe contents of the three kinds of triterpenes decreased during the processing，and the reduction rates were 13.43%，15.15%，and 14.79%，respectively.The IC50values of IEC-6 cells were 71.41，15.27，and 14.53μmol/L，respectively，after being pretreated with triterpenes.CONCLUSIONThe experimental data indicate that there is a certain correlation between the reduction in the three kinds of triterpenes' contents and the attenuation during processing with vinegar.

Kansui Radix；processing with vinegar；IEC-6；euphol；kansenone；11-oxo-kansenonol

R283

：A

：1001-1528（2015）05-1045-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.026

2014-07-24

國家自然科學(xué)基金項目 （30973940，81373972）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃 （973） 項目 （2011CB505300，2011CB505303）；江蘇省 “六大人才高峰”項目 （2010年度）；江蘇省政府留學(xué)獎學(xué)金項目 （JS-2009-061）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目（ysxk-2014）

王文曉，碩士生。Tel：18252066631，E-mail：zwangwenxiao@163.com

*通信作者：張 麗，教授，從事中藥炮制與質(zhì)量控制研究，Tel：（025）85811519，E-mail：zhangliguanxiong@163.com