HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定酸棗仁皂苷中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇

曹相蘭， 周 雯， 謝憲斌， 孟 飛， 符敬偉， 喬 衛(wèi)

（天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070）

HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定酸棗仁皂苷中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇

曹相蘭， 周 雯， 謝憲斌， 孟 飛， 符敬偉， 喬 衛(wèi)*

（天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，天津300070）

目的采用HPLC-DAD法同時(shí)定量測(cè)定酸棗仁皂苷中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇。方法酸棗仁以甲醇提取，采用Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）色譜柱，乙腈-水為流動(dòng)相梯度洗脫，體積流量1 mL/min，運(yùn)行時(shí)間120 min，檢測(cè)波長204 nm，柱溫35℃。結(jié)果4種成分的進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系（r≥0.999 0）；加樣回收率為99.2%～100.2%。結(jié)論經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，所采用的測(cè)定方法準(zhǔn)確穩(wěn)定，靈敏度高，可作為酸棗仁皂苷多指標(biāo)定量測(cè)定方法。

酸棗仁；酸棗仁皂苷A；酸棗仁皂苷B；白樺脂酸；白樺脂醇；HPLC-DAD

據(jù)報(bào)道，很多中藥及天然藥物具有抗抑郁效果，不僅療效與西藥相當(dāng)，還能明顯提高患者整體生活質(zhì)量，具有減少疾病復(fù)發(fā)、藥物副反應(yīng)少、患者依從性好等明顯的優(yōu)勢(shì)［1］。中藥有效部位雖然能顯現(xiàn)出藥材的整體療效，但由于 “質(zhì)量不可控，安全不可靠”，成為制約中藥現(xiàn)代化的瓶頸。藥材及其有效部位中有效成分的絕對(duì)含量能直接反映它們的質(zhì)量，并對(duì)飲片、提取物以及制劑的質(zhì)量產(chǎn)生影響。研究表明，酸棗仁及其皂苷部位具有抗抑郁作用［2］，而且酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇為有效成分［3］。目前，對(duì)酸棗仁皂苷的定量測(cè)定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道［4-5］，但大多是針對(duì)酸棗仁總皂苷或酸棗仁皂苷中的某種成分進(jìn)行分析［6-7］。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC-DAD法，對(duì)酸棗仁皂苷中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇4種成分同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，為酸棗仁皂苷質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 酸棗仁皂苷A（批號(hào)0734-9705）、酸棗仁皂苷B（批號(hào)814-9301）對(duì)照品，購于中國藥品生物制品檢定所；白樺脂酸、白樺脂醇對(duì)照品（純度≥98%），購于上海順勃生物工程技術(shù)有限公司；酸棗仁為市售藥材，經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)生藥教研室周曄教授鑒定；乙腈為色譜純 （美國Fisher Scientific公司）；水為超純水（自制）。

1.2 儀器 蘭博高效液相色譜儀（美國SSI/LabAlliance公司）；Spectra SysteMUV6000LP檢測(cè)器（美國TSP公司）；EzchroMElite工作站（日本日立高新技術(shù)公司）；BP211D十萬分之一分析天平（上海君達(dá)儀器廠）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；超純水 （德國Millipore Ultra-pure Water公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent TC-C18柱色譜（4.6 mm× 250 mm，5μm）；流動(dòng)相為乙腈 （A）-水 （B），梯度洗脫（0 min，15%A；0～10 min，15～25% A；10～20 min，25～45%A；20～30 min，45～65%A；30～45 min，65～70%A；45～55 min，70%A；55～70 min，70～80%A；70～90 min，80～100%A；90～120 min，100%A），運(yùn)行時(shí)間120 min，檢測(cè)波長204 nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量20μL。在此條件下，各色譜峰分離度良好，見圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、白樺脂酸、白樺脂醇對(duì)照品適量，加甲醇分別制成酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、白樺脂酸、白樺脂醇質(zhì)量濃度分別為3.2、2.4、16.0、1.6 mg/mL的單一對(duì)照品溶液。

2.2.2 酸棗仁皂苷部位提取物的制備 取干燥粉碎后的酸棗仁藥材，用3倍量的石油醚在70℃下回流脫脂3次，每次分別進(jìn)行2、1、1 h，再以6倍量、6倍量、4倍量70%乙醇在95℃下回流提取3次，每次分別進(jìn)行3、2、1 h，合并乙醇提取液，減壓蒸餾，濃縮至無醇味。加蒸餾水混懸，用正丁醇萃取3次，合并萃取液，減壓濃縮，以1% NaOH水溶液萃取2次，收集上層 （正丁醇層），以正丁醇飽和水洗至中性后，加入1%HCl水溶液萃取1次，再次用正丁醇飽和水洗至中性，收集正丁醇層，減壓濃縮，即得酸棗仁皂苷部位提取物。

2.2.3 供試品溶液的制備 取酸棗仁皂苷部位粉末0.08 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得皂苷部位供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察［8-10］

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取 “2.2.1”項(xiàng)下制備的酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、白樺脂酸、白樺脂醇對(duì)照品溶液各2.5、1.8、1.3、0.6、0.3、0.15mL，分別至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成6種不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液。依次吸取混合對(duì)照品溶液各20μL注入高效液相色譜儀中，記錄峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo) （X），以峰面積為縱坐標(biāo) （Y），計(jì)算回歸方程。相應(yīng)的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù) （r）和線性范圍分別為：酸棗仁皂苷A Y=31 992X-86 180（r=0.999 3），線性范圍1.00～16.00μg；酸棗仁皂苷B Y=30 824X-23 938（r=0.999 5），線性范圍0.50～12.00μg；白樺脂酸Y=77 095X-6× 106（r=0.999 0），線性范圍2.50～40.00μg；白樺脂醇Y=69 369X-5×106（r=0.999 7），線性范圍0.25～4.00μg。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液20μL，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）分別為1.7%、1.4%、1.7%、1.0%，表明儀器精密度良好，符合要求。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)樣品6份，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，計(jì)算。結(jié)果酸棗仁皂苷部位中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇的RSD分別為1.8%、1.8%、1.3%、1.2%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份樣品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2.5、5、7.5、10、24 h精密吸取20μL進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇峰面積RSD分別為1.4%、1.7%、1.5%、1.8%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 加樣回收試驗(yàn) 取同一批次 （批號(hào)20130602）含有量已知的酸棗仁皂苷樣品9份，精密稱定，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備樣品溶液，按相當(dāng)于樣品溶液中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇含有量的80%、100%、120%加入 “2.2.1”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，按 “2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇的平均回收率，結(jié)果見表1。

2.3.6 樣品測(cè)定 取3批酸棗仁皂苷樣品，每批3份，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算酸棗仁皂苷樣品中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸、白樺脂醇的量，結(jié)果見表2。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)流動(dòng)相梯度條件進(jìn)行了優(yōu)化，在此色譜條件下，4種主要有效成分酸棗仁皂苷A、酸棗仁皂苷B、白樺脂酸、白樺脂醇能達(dá)到完全分離，且不與其他成分發(fā)生重疊，達(dá)到一次進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定4種成分的目的，可以節(jié)約測(cè)量時(shí)間，簡化測(cè)量步驟，降低工作量，減少檢驗(yàn)成本。

在前期建立的應(yīng)用HPLC同時(shí)測(cè)定酸棗仁及其皂苷部位中酸棗仁皂苷A、B方法的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)參考 《中國藥典》［11］和文獻(xiàn)［12］，采用HPLCDAD法同時(shí)測(cè)定其中4種指標(biāo)成分。經(jīng)驗(yàn)證，該方法準(zhǔn)確穩(wěn)定，靈敏度高，可作為酸棗仁皂苷多指標(biāo)定量測(cè)定的方法。由于這4種成分均為直接發(fā)揮抗抑郁藥效的有效成分，因此通過測(cè)定它們的含有量可以評(píng)價(jià)抗抑郁藥效，確定酸棗仁的臨床用量，還能間接反映酸棗仁藥材的質(zhì)量。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.1 Results of recovery tests（n=9）

表2 酸棗仁皂苷樣品中4種成分的測(cè)定結(jié)果 （n=3）Tab.2 Contents of four constituents in ju jubosides froMZiziphi spinosae Semen（n=3）

參考文獻(xiàn)：

［1］陳慧媧，尹紹峰.抑郁癥的中醫(yī)藥研究進(jìn)展［J］.黑龍江中醫(yī)藥，2011，40（2）：53-55.

［2］田秀紅，黎 梅.酸棗活性成分分析及藥理作用研究進(jìn)展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（23）：11555-11557.

［3］喬 衛(wèi)，段宏泉，孫 燕，等.白樺脂醇、白樺脂酸的新用途：中國，201410092538.X［P］.2014-03-13.

［4］劉昌輝，黃小桃，李穎儀，等.LC-MS/MS法測(cè)定酸棗仁中酸棗仁皂苷A、B和斯皮諾素的含量［J］.中藥新藥與臨床藥理，2012，23（1）：69-72.

［5］張 雪，向瑞平.酸棗仁中皂苷A的含量測(cè)定研究［J］.鄭州牧業(yè)工程高等?？茖W(xué)校學(xué)報(bào)，2010，30（3）：7-9.

［6］程小麗，張 偉.酸棗仁總皂苷的提取分離及含量測(cè)定［J］.陜西中醫(yī)，2012，33（5）：607-609.

［7］吳 闖，張 健，殷志琦，等.HPLC測(cè)定酸棗仁中白樺酸的含量［J］.藥物生物技術(shù)，2010，17（3）：244-246.

［8］劉婧姝，喬 衛(wèi)，郝蘭芳，等.酸棗仁合歡方中酸棗仁皂苷A的薄層色譜鑒別和含量測(cè)定［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（5）：77-79.

［9］Zhang MC，Zhang Y Q，Xie JB.Simultaneous determination of jujuboside A，B and betulinic acid in Semen ZiziphiSpinosae by high performance liquid chromatography-evaporative light scattering detection［J］.J PharMBiomed Anal，2008，48（5）：1467-1470.

［10］Bao K D，Li P，Li H J，et al.Simultaneous determination of flavonoidsand saponins in Semen ZiziphiSpinosae（Suanzaoren）by high performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection［J］.Chin J Nat Med，2009，7（1）：47-53.

［11］國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：2010年版一部［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：343-344.

［12］吳玉蘭，許惠琴，陳 詵，等.酸棗仁不同炮制品及炒酸棗仁中總黃酮與總皂苷的鎮(zhèn)靜催眠作用比較［J］.時(shí)珍國醫(yī)國藥，2005，16（9）：868-869.

SiMultaneous deterMination of jujuboside A，jujuboside B，betulinic and betulin froMZizyphi Sponosae Semen by HPLC-DAD

CAO Xiang-lan， ZHOUWen， XIE Xian-bin， MENG Fei， FU Jing-wei， QIAOWei*
（Tianjin Key Laboratory of Technologies Enabling Developmentof Clinical Therapeutics and Diagnostics；School of Pharmacy，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China）

AIMTo establish an HPLC-DADmethod for simultaneously determining the contents of jujuboside A，jujuboside B，betulinic and betulin in jujubosides froMZiziphi Spinosae Semen.METHODSThe assay of methanolic extract of jujubosides was performed on Agilent TC-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）column in gradient elution prograMwith acetonitrile-water asmobile phase at flow rate of 1 ML/min.The detection wavelength was set at204 nMand column temperature at35℃.RESULTSThe linear ranges of four active components were good（r≥0.999 0）between sample sizes and peak areas.The average recoveries fellwithin 99.2%-100.2%.CONCLUSIONThemethod is accurate and stable，and can be used as amulti-index simultaneous determination of jujubosides.

Zizyphi Sponosae Semen；jujuboside A；jujuboside B；betulinic；betulin；HPLC-DAD

R284.1

：A

：1001-1528（2015）05-1013-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.019

2014-09-13

國家自然科學(xué)基金 （81173530）；天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目 （12YFJZJC08100）

曹相蘭（1988—），女，碩士，研究方向?yàn)橹兴幏治雠c藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。E-mail：caoxlany@163.com

*通信作者：喬 衛(wèi)（1968—），女，博士，教授，研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)與中藥藥理。E-mail：qiaowei1205@126.com