一測多評法測定中成藥中洋川芎內酯A和藁本內酯

楊 艷， 易進海， 劉云華， 黃志芳， 劉玉紅， 陳 燕

（1.四川省中醫(yī)藥科學院，四川成都610041；2.瀘州醫(yī)學院，四川瀘州646000）

一測多評法測定中成藥中洋川芎內酯A和藁本內酯

楊 艷1，2， 易進海1*， 劉云華1， 黃志芳1， 劉玉紅1， 陳 燕1

（1.四川省中醫(yī)藥科學院，四川成都610041；2.瀘州醫(yī)學院，四川瀘州646000）

目的以丁苯酞為內標一測多評法測定都梁滴丸、白帶丸、血府逐瘀膠囊中洋川芎內酯A和藁本內酯。方法

都梁滴丸；白帶丸；血府逐瘀膠囊；相對校正因子；洋川芎內酯A；藁本內酯；丁苯酞；一測多評

川芎、當歸在中成藥中廣泛應用，二者的化學成分和功效有相似之處，其揮發(fā)油成分為苯酞類衍生物，與川芎、當歸的功能主治密切相關，主要代表性有效成分為藁本內酯（ligustilide）和洋川芎內酯A（senkyunolide A）［1-3］，故應測定該類成分的含有量以便客觀評價和控制中成藥的質量。目前文獻報道均是以洋川芎內酯A和藁本內酯為對照品，采用外標法測其二者的含有量［4-6］；但洋川芎內酯A和藁本內酯穩(wěn)定性差，不宜作為法定的含量測定用對照品。本課題組前期報道了以穩(wěn)定的丁苯酞作為替代對照品，采用雙波長檢測，同時測定川芎中丁苯酞和藁本內酯的量，但丁苯酞的含有量很低［7］。本實驗以含川芎和/或當歸的都梁滴丸、白帶丸和血府逐瘀膠囊為代表性藥物，進一步改進分析方法，以丁苯酞為內標，采用單波長檢測，“一測多評”法測定主要有效成分洋川芎內酯A和藁本內酯的量，并與外標法測定結果進行比較，結果表明該方法簡便適用可行，為中成藥中川芎、當歸的質量控制提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent1200高效液相色譜系統(tǒng)；Waters1525-2487高效液相色譜系統(tǒng)，Breeze液相色譜工作站；Agilent1100高效液相色譜系統(tǒng)；Agilent Eclipse XDB-C18（4.6mm×150mm，5μm），Phenomenex Luna C18（4.6 mm×150 mm，5μm），Agilent Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm），島津AUX220型萬分之一電子天平，島津AUW220D型十萬分之一電子天平，KQ-300B型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）。

丁苯酞對照品 （批號101035-200901）購自中國食品藥品檢定研究院，供含量測定用，洋川芎內酯A和藁本內酯對照品由本實驗室自制，經(jīng)核磁共振波譜法［8-9］測定其純度分別為 90.61%和92.80%。都梁滴丸樣品 （批號分別為 140403，131004，120702）為市售品 （北京九龍制藥有限公司），白帶丸樣品 （批號分別為 1401083，130118，130606）為市售品 （河北萬歲藥業(yè)有限公司），血府逐瘀膠囊樣品 （批號分別為C03033，D03041，C03208）為市售品 （天津宏仁堂藥業(yè)有限公司）。甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 測定波長的選擇 取丁苯酞、洋川芎內酯A和藳本內酯對照品，在200～400 nm范圍內掃描，測得其紫外吸收光譜見圖1。由圖1可見，丁苯酞、洋川芎內酯A和藁本內酯三者在波長280 nm處均有較大吸收，故采用280 nm單波長檢測測定。

圖1 丁苯酞 （A）、洋川芎內酯A（B）和藁本內酯 （C）的紫外吸收圖譜Fig.1 UV spectruMof butylphthalide（A），senkyunolide A（B）and ligustilide（C）

2.2 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；流動相為甲醇-水（52∶48）；體積流量為1.0 mL/min；柱溫為35℃；進樣量10μL；檢測波長280 nm。上述色譜條件下，各成分分離良好，陰性樣品無干擾，結果見圖2。

2.3 混合對照品溶液的制備 稱取對照品丁苯酞、藁本內酯和洋川芎內酯A適量，精密稱定，加無水乙醇分別制成每1 mL含丁苯酞1.994 mg，藁本內酯0.806 7 mg，洋川芎內酯A 0.434 6 mg的溶液，作為貯備液。分別精密量取上述對照品貯備溶液各1 mL，置同一10 mL棕色量瓶中，加流動相至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液 （每1 mL含丁苯酞199.4μg，含藁本內酯80.67μg，含洋川芎內酯A 43.46μg）。

2.4 供試品溶液的制備 都梁滴丸、白帶丸粉碎過三號篩，取二者粉末和血府逐瘀膠囊內容物約1～1.5 g，精密稱定，分別置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ML，稱定質量，超聲處理（100 W，40 kHz）40 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，置棕色瓶中，即得供試品溶液。

2.5 陰性樣品溶液的制備 按照都梁滴丸、白帶丸和血府逐瘀膠囊的處方和制法，制成不含川芎、當歸的陰性樣品，并按供試品溶液的制備方法制成陰性樣品溶液。

圖2 混合對照品 （A）、都梁滴丸 （B）、都梁滴丸陰性 （C）、白帶丸 （D）、白帶丸陰性 （E）、血府逐瘀膠囊（F）及血府逐瘀膠囊陰性（G）HPLC圖Fig.2 HPLC chromatograMs ofMixture reterence substances（A），Duliang Dropping Pills（B），negative saMp le of Duliang Dropping Pills（C），Baidai Pills（D），negative saMp le of Baidai Pills（E），Xuefu Zhuyu Capsules（F）and negative saMp le of Xuefu Zhuyu Capsu les（G）

2.6 方法學考察

2.6.1 線性關系考察、檢測限和定量限測定 精密吸取上述混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按 “2.2”項下方法分別測定丁苯酞、洋川芎內酯A和藁本內酯的峰面積，重復3次，取平均值。以進樣量X為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，結果見表1。當信噪比 （S/N）為3時的被測物質量為檢測限，信噪比 （S/N）為10時的被測質量為定量限，據(jù)此測得丁苯酞、洋川芎內酯A和藁本內酯的檢測限和定量限見表1。

表1 3個成分的標準曲線、檢測限和定量限Tab.1 L iner correlation，liMit of detection and liMit of quantitation of three coMponents

2.6.2 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液10 μL，按 “2.2”項下方法連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，洋川芎內酯A和藁本內酯峰面積的RSD均為0.1%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、6、8、24 h進樣測定峰面積，洋川芎內酯A和藁本內酯峰面積的RSD均為1.8%，表明供試品溶液在24 h內測定，結果穩(wěn)定。

2.6.4 重復性試驗 取都梁滴丸粉末 （批號140403）1 g，精密稱定，共6份，按 “2.4”項下方法制備樣品，測定，洋川芎內酯A和藁本內酯的平均含有量分別為0.069 3%和0.067 8%，RSD分別為0.6%和1.8%。表明該方法的重復性良好。2.6.5 加樣回收試驗 取都梁滴丸粉末 （批號140403）0.5 g，精密稱定，共6份，分別精密加入含洋川芎內酯A（0.3520 mg/mL）和藁本內酯（0.339 0 mg/mL）的對照品溶液各1 mL，按“2.4”項下方法制備樣品，測定并計算加樣回收率，洋川芎內酯A和藁本內酯的平均回收率分別為99.7%和100.0%，RSD分別為1.2%和1.5%。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.2 Result of recovery tests（n=6）

2.6.6 相對校正因子的測定 以丁苯酞作為內標物，按照公式相對校正因子 （f）=（Ai×Cr）/（Ar×Ci）［7］（Ai為替代對照品的峰面積；Ar為真實對照品的峰面積；Ci為替代對照品的濃度；Cr為真實對照品的濃度），計算6個不同進樣量時洋川芎內酯A對丁苯酞的校正因子f1和藁本內酯對丁苯酞的校正因子f2的平均值。結果見表3。

2.6.7 校正因子的重現(xiàn)性考察 采用Agilent E-clipse XDB-C18色譜柱，分別考察了Agilent1200、Agilent1100和Waters1525-2487液相色譜系統(tǒng)；采用Agilent1200液相色譜儀，考察了3種不同型號的色譜柱（Agilent Eclipse XDB-C18、Phenomenex Luna C18、Agilent Zorbax SB-C18）；采用Agilent1200、Agilent Eclipse XDB-C18柱分別考察了不同柱溫 （25℃、30℃、35℃）、不同儀器體積流量（0.9、1.0、1.1 mL/min）對校正因子的影響，結果見表4，表明相對校正因子的重現(xiàn)性良好（RSD＜2%）。

表3 相對校正因子計算結果 （n=3）Tab.3 Result of the relative correction factors

表4 相對校正因子重現(xiàn)性考察結果 （n=3）Tab.4 Reproducibility of relative correction factors（n=3）

2.6.8 待測組分色譜峰的定位 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，只使用丁苯酞作為對照品時，引入兩組分的相對保留時間值并結合色譜峰的紫外吸收光譜特征可以作為定位藁本內酯峰和洋川芎內酯A峰的標準。本實驗考察了在不同品牌儀器和不同規(guī)格色譜柱中的重復性，得到洋川芎內酯A對丁苯酞的相對保留時間的平均值為0.91，藁本內酯對丁苯酞的相對保留時間的平均值為1.64，RSD分別為0.4%和1.3% （n=6）。表明不同品牌色譜儀和不同規(guī)格的色譜柱對相對保留時間值的影響不大，因此，可以根據(jù)相對保留時間值來定位藁本內酯峰和洋川芎內酯A色譜峰。

2.7 一測多評法與外標法測定結果的比較 本實驗以外標法和一測多評法分別測定3批都梁滴丸、白帶丸、血府逐瘀膠囊中洋川芎內酯A和藁本內酯的含量，結果見表5。表明一測多評法計算值與外標法實測值之間沒有明顯差異，說明建立的相對校正因子具有很好的重現(xiàn)性和可信度，在定量用對照品缺乏情況下，可以通過一測多評法實現(xiàn)對都梁滴丸、白帶丸和血府逐瘀膠囊中洋川芎內酯A和藁本內酯含有量的同步測定。

表5 兩種方法測得中成藥中洋川芎內酯A和藁本內酯結果比較（%，n=3）Tab.5 CoMparision of contents of ligustilide and senkyunolide A in Chinese patent medicines by two methods（%，n=3）

3 討論

采用 “一測多評”法進行多成分的質量評價，各成分相對校正因子的確定和待測成分色譜峰的定位很重要。本實驗考察了影響相對校正因子重現(xiàn)性的儀器、色譜柱、柱溫和體積流量，結果表明相對校正因子具有較好的可靠性。在進行待測成分色譜峰定位時，分別對保留時間和相對保留值進行了考察，表明相對保留值重現(xiàn)性較好，RSD小于5%，因此采用相對保留值作為定位待測成分色譜峰的依據(jù)。此外，還可以與川芎、當歸對照藥材的色譜峰進行比對，以及進一步驗證待測成分的紫外吸收光譜，確保色譜峰定位準確可靠。

都梁滴丸由川芎、白芷組成，血府逐瘀膠囊由川芎、當歸等十一味中藥組成，白帶丸由當歸等五味中藥組成。都梁滴丸和血府逐瘀膠囊能同時檢測出洋川芎內酯A和藁本內酯，而白帶丸僅檢測出藁本內酯，與文獻報道當歸不含洋川芎內酯A相符［8-9］。本實驗采用法定對照品丁苯酞為內標，同時測定中成藥中洋川芎內酯A和藁本內酯的量，該方法簡便適用可行，解決了對照品不穩(wěn)定的難題。

洋川芎內酯A和藁本內酯對照品不穩(wěn)定，制備后應立即使用或置-20℃短期保存，臨用時應重新標定其含量。由于二者穩(wěn)定性差，為油狀物質，在制備過程中常殘留部分溶劑或降解產(chǎn)物，HPLC峰面積歸一化法測得的純度往往偏高，因此，本實驗采用核磁共振波譜法［10-11］測得洋川芎內酯A、藁本內酯對照品的絕對含有量分別為90.61%和92.80%，進行相對校正因子測定，保證測定結果的準確可靠。

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DeterMination of senkyunolide A and ligustilide in Chinese tranditional patent medicines by QAMS

YANG Yan1，2， YI Jin-hai1*， LIU Yun-hua1， HUANG Zhi-fang1， LIU Yu-hong1， CHEN Yan1
（1.Sichuan Provincial Academy of Chinese Medicine Sciences，Chengdu 610041，China；2.Luzhou Medical College，Luzhou 646000，China）

AIMTo take butylphalide as the internal reference standard to establish an HPLCmethod for simultaneously determining senkyunolide A and ligustilide in Duliang Dropping Pills，Baidai Pills and Xuefu Zhuyu Capsules using quantitative analysis ofmulti-components by singlemarker（QAMS）.METHODSThe analyses ofmethanolic extracts of above pills and capsules were performed on Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150 mm，5μm）column with methanol-water（52∶48）asmobile phase，the relative correction factors of ligustilide and senkyunolide A weremeasured and their reproducibility examined under different conditions，and the comparison wasmade with external standardmethod.RESULTSThe contents of senkyunolide A and ligustilide in Duliang Dropping Pills and Xuefu Zhuyu Capsuleswere found，only ligustilide in Baidai Pillswas detected.The relative correction factors presented good reproducibility on Agilent Eclipse XDB-C18，Phenomenex Luna C18and Agilent Zorbax SB-C18columns.There was no significant difference between QAMS and external standard method.CONCLUSIONThe adopted QAMS can be applied to the quality control of Chuanxiong Rhzoma and Angelicae sinensis Radix in aid of solving the instability of senkyunolide A and ligustilide.

Duliang Dropping Pills；Baidai Pills；Xuefu Zhuyu Capsules；relative correction factor；senkyunolide A；ligustilide；butylphalide；quantitative analysis ofmulti-components by single marker（QAMS）

R927.2

：A

：1001-1528（2015）05-1000-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.05.016

2014-10-19

2015年版中國藥典科研計劃；中國科學院重點部署項目 （KSZD-EW-Z-004）

楊 艷（1990—），女，碩士，研究方向為中藥化學成分與質量標準。E-mail：154984840@qq.com

*通信作者：易進海（1963—），男，研究員，研究方向為中藥化學成分與質量評價。Tel： （028）85210843，E-mail：yijinhai63@ 163.com

待測藥物以甲醇提取，HPLC分析采用的色譜柱為Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150mm，5μm），流動相為甲醇-水 （52∶48）。測定洋川芎內酯A和藁本內酯的相對校正因子，考察其校正因子的重現(xiàn)性，并與外標法進行比較。結果都梁滴丸和血府逐瘀膠囊能同時檢測出洋川芎內酯A和藁本內酯，而白帶丸僅檢測出藁本內酯。在Agilent E-clipse XDB-C18、Phenomenex Luna C18和Agilent Zorbax SB-C18色譜柱上測定的相對校正因子重現(xiàn)性好，與外標法實測值無顯著差異。結論本法可用于川芎、當歸的質量控制，解決了洋川芎內酯A和藁本內酯對照品不穩(wěn)定的難題。