響應(yīng)面法優(yōu)化毛雞骨草葉中黃酮成分提取工藝

張 平， 李春陽(yáng)， 袁旭江

(廣東藥學(xué)院中藥開(kāi)發(fā)研究所，廣東 廣州510006)

毛雞骨草為豆科植物毛相思子Abrus mollis Hance 的干燥全草，又名大葉雞骨草，是廣西特產(chǎn)藥材，常作雞骨草替用品，其味甘、淡，性涼，具有清熱解毒、利濕、舒肝止痛的功效，主要用于治療急慢性肝炎、肝硬化腹水、胃痛等病癥［1］。研究表明，芹菜素黃酮碳苷類化合物為毛雞骨草保肝的主要藥效活性成分之一，另外還含有降酶、降酯等藥效活性［2-5］，其中含有量最高的黃酮成分主要為芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷［6］。由于毛雞骨草根、莖、葉所含黃酮成分的差異較大，尤以葉片中含有量最高［7］，而且相關(guān)的研究文獻(xiàn)較少，因此本研究在HPLC 基礎(chǔ)上運(yùn)用Box-Behnken 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法［8-10］優(yōu)選毛雞骨草葉中黃酮成分的提取工藝。在優(yōu)化過(guò)程中，對(duì)試驗(yàn)因素各水平進(jìn)行分析，克服了以往正交試驗(yàn)［11-12］只能對(duì)孤立點(diǎn)進(jìn)行分析，而不能給出直觀圖形的缺陷［13］，并以芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷這三個(gè)主要黃酮成分含有量的總和為指標(biāo)響應(yīng)值，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為主要影響因素，用于考察并篩選出最佳提取工藝，可為毛雞骨草葉的新藥研究和資源開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與設(shè)備 Agilent 1100 HPLC 色譜儀，包括DAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司);KQ 3200 超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);JJ1000 電子天平(常熟市雙杰測(cè)試儀器廠);BP 211D 電子天平(德國(guó)Sartorius 公司);RE-52 AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 主要材料與試劑 芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷對(duì)照品(自制，經(jīng)HPLC 測(cè)定，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%)。毛雞骨草葉采于廣西省玉林市，經(jīng)廣東藥學(xué)院袁旭江副研究員鑒定為豆科植物毛相思子Abrus mollis Hance 的干燥葉片。甲醇、乙醇等試劑均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);水為超純水(自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件［14］Hypersil BDS C18色譜柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇(A)-0.2%乙酸水溶液(B)，梯度洗脫(0 ～30 min，20% ～48% A;30 ～35 min，48% ～95% A);體積流量1.0 mL/min;柱溫25℃;檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm;進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密稱取三種對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成每1 mL 含芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖苷0.078 mg、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷0.175 mg、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷0.102 mg 的混合對(duì)照品溶液。然后，分別精密吸取1、2、4、6、8、10 μL，注入HPLC 色譜儀進(jìn)行測(cè)定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)，峰面積(mAu/min )為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。由表可知，芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷在一定劑量范圍內(nèi)的線性關(guān)系均良好。

表1 3 種對(duì)照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取毛雞骨草葉粉末(過(guò)18 目篩)約1.0 g，加入20 倍量60%乙醇，稱定質(zhì)量，超聲處理(120 W，40 KHz)30 min 后冷卻，60%乙醇補(bǔ)足缺失重量，提取2 次，合并，60%乙醇定容至100 mL，過(guò)濾，即得。

2.1.4 HPLC 含有量測(cè)定的專屬性考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品以及“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，注入HPLC 色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，兩者在相同位置均有吸收，分離度均大于1.5，塔板數(shù)按芹菜素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷計(jì)，均不低于3 000，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品(A)和供試品(B)色譜圖

2.1.5 方法學(xué)考察 精密吸取“2.1.3”項(xiàng)下供試品溶液10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得3種對(duì)照品的峰面積RSD 分別為1.4%、1.5%、1.2%，表明儀器精密度良好。然后，再分別于2、4、6、8、12、24 h 進(jìn)樣，在相同條件下測(cè)得三者峰面積RSD 分別為1.6%、1.4%、1.4%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。接著，取同一批毛雞骨草葉提取液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，測(cè)得三者平均含有量分別為8.9、15.0、10.4 mg/g，RSD 分別為1.3%、1.2%、1.3%。另外，加樣回收率試驗(yàn)測(cè)得三者平均回收率分別為99.32%、99.40%、99.18%，RSD 分別為1.4%、1.2%、0.87%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

2.2 響應(yīng)面法提取工藝的設(shè)計(jì)

2.2.1 提取工藝的設(shè)計(jì) 精密稱取毛雞骨草葉粉末(過(guò)18目篩)約1.0 g，加入相應(yīng)體積的乙醇，稱定質(zhì)量，超聲處理(120 W，40 KHz)一定時(shí)間后冷卻，乙醇補(bǔ)足缺失質(zhì)量，合并，定容，過(guò)濾，濾液上HPLC 測(cè)定。然后，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)得三種對(duì)照品的含有量，計(jì)算其總量(得率)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

2.2.2 工藝影響因素的設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為考察因素，Design-Expert8.0.6 軟件設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，見(jiàn)表2。然后，根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以黃酮含有量(Y)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果共有29 個(gè)試驗(yàn)，其中24 個(gè)為析因試驗(yàn)，另外5 個(gè)為中心試驗(yàn)，用于估算誤差，見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平

2.3 黃酮類含有量測(cè)定結(jié)果 分別精密吸取29 個(gè)試驗(yàn)樣品溶液10 μL，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下，測(cè)定3 種對(duì)照品的含有量，并計(jì)算其總和，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表4 模型方差分析

2.5 響應(yīng)曲面的分析 采用響應(yīng)面軟件，分析乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)之間的交互作用對(duì)黃酮得率的影響，并繪制響應(yīng)曲面圖，見(jiàn)圖2。由圖可知，以上4 種因素對(duì)黃酮成分的含有量均可產(chǎn)生影響。其中，圖2D 和2F 中兩因素的交互作用極顯著，圖2C 中兩因素的交互作用非常顯著，圖2E 中兩因素的交互作用顯著，而圖2A 和2B 中兩因素的交互作用不顯著。

2.6 最佳提取工藝 采用Design-expert 8.0.6 軟件進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)毛雞骨草葉中3 種對(duì)照品的最佳提取工藝條件為59.80%乙醇，液料比34.67 ∶1，提取時(shí)間45 min，提取次數(shù)3 次，該條件下的黃酮含有量為36.60 mg/g。結(jié)合實(shí)際情況，最終確定為60%乙醇，液料比35 ∶1，提取時(shí)間45 min，提取次數(shù)3 次。然后，精密稱取毛雞骨草粉末1 g，平行3 份，將上述優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)三者含有量分別為35.50、35.44、35.54 mg/g，與預(yù)測(cè)值36.60 mg/g 基本一致，說(shuō)明該方程與實(shí)際情況擬合良好，從而驗(yàn)證了所建模型的正確性。

3 討論

3.1 含有量測(cè)定方法 本實(shí)驗(yàn)所用的HPLC 法是在前期研究結(jié)果［14］的基礎(chǔ)上，作進(jìn)一步優(yōu)化而得到的，并且該方法更快捷、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定。

3.2 提取方法 本實(shí)驗(yàn)比較了回流提取與超聲提取的差異，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)黃酮成分含有量差異的影響均不大。由于后者更簡(jiǎn)單快速，故選擇超聲提取法。

圖2 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

3.3 單因素試驗(yàn) 前期選取了乙醇體積分?jǐn)?shù)(0%、20%、40%、60%、80%、95%)、液料比(10 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1)、提取時(shí)間(15、30、60、90、120 min)和提取次數(shù)(1、2、3、4 次)這四個(gè)影響因素進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，各因素的最佳范圍為乙醇體積分?jǐn)?shù)20% ～60%，液料比20 ∶1 ～40 ∶1，提取時(shí)間15 ～60 min，提取次數(shù)1 ～3 次。

3.4 提取工藝 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果表明，乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取時(shí)間和提取次數(shù)等因素均能影響黃酮成分的提取率，并經(jīng)二次多項(xiàng)回歸模型，得到了最佳提取工藝，其黃酮成分的實(shí)測(cè)值與預(yù)測(cè)值相吻合，說(shuō)明了Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)具有良好的可行性，并且響應(yīng)面法能較好地對(duì)毛雞骨草葉中黃酮成分的超聲提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

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