苦瓜根總皂苷的提取及其對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的研究

彭曉赟， 陳紫東， 尹志芳， 鐘桐生， 楊小琴， 趙運(yùn)林*

(1. 湖南城市學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖南益陽413000;2. 陜西省榆林市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，陜西榆林719000)

苦瓜Momordica charantia L 屬于葫蘆科植物，廣泛種植于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是人們生活中的一種常用蔬菜，同時(shí)也是功能食品原料［1-2］。皂苷是存在于植物界的一類比較復(fù)雜的化合物，是由皂苷元和糖基部分組成，苦瓜中的這類物質(zhì)主要為三萜類和甾體類皂苷［3-6］，其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，由于自身的羥基結(jié)構(gòu)可能是某種酶的作用位點(diǎn)，因而具有良好的生理活性，研究表明，苦瓜皂苷具有降血糖的作用［7-11］。體外α-葡萄糖苷酶抑制試驗(yàn)可以從一定程度上反映活性物質(zhì)通過抑制糖苷酶活性而發(fā)揮降血糖作用，是一種較為快捷的降糖藥物篩選方法［12-14］。目前，對(duì)苦瓜皂苷的研究多集中在果實(shí)和種子部位，而僅有陳林等人對(duì)其根部做過皂苷含有量和不同溶劑提取物的降糖活性研究［15-16］，故為了開發(fā)利用苦瓜根資源，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了正交試驗(yàn)，對(duì)影響苦瓜根總皂苷提取效果的溫度、浸泡時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比這四個(gè)因素進(jìn)行考察，選擇最佳提取工藝，并以人參皂苷Rb1為指標(biāo)，采用高氯酸-香草醛-冰醋酸比色法對(duì)其含有量進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，以體外α-葡萄糖苷酶抑制率為指標(biāo)，評(píng)價(jià)苦瓜根總皂苷的降血糖效果，旨在為進(jìn)一步合理利用苦瓜資源奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑 苦瓜根(湖南城市學(xué)院周邊農(nóng)田)。無水乙醇、石油醚、甲醇、正丁醇、香草醛、冰乙酸、高氯酸、碳酸鈉等均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。96 孔板(美國Corning Costar 公司);α-葡萄糖苷酶、對(duì)-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、DMSO (美國Sigma 公司);牛血清白蛋白(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);阿卡波糖(美國TCI 公司);人參皂苷Rb1對(duì)照品(純度≥98%，成都曼斯特生物科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 UV3010 紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司);GZX-9076MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司);AvantiJ25 高速冷凍離心機(jī)(美國Beckman 公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司);中藥粉碎機(jī)(北京興時(shí)利和科技發(fā)展有限公司);W-O 型數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市金祥龍電子有限公司);SHZ-D (Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器有限公司);電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);FD-1PF 真空冷凍干燥機(jī)(北京德天佑科技發(fā)展有限公司);MultiSkan FC 酶標(biāo)儀(美國熱電公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 苦瓜根總皂苷的提取方法 (1)苦瓜根原料前處理。將苦瓜根洗凈，陰干，40 目篩粉碎，得到苦瓜根粉，密封保存?zhèn)溆谩?2)苦瓜皂苷的定量分析。按照崔恒林等報(bào)道的方法［17］提取苦瓜根中的總皂苷，提取液依次經(jīng)石油醚和水飽和正丁醇萃取后，正丁醇部位經(jīng)60 ℃減壓濃縮，得到褐色稠狀物，用甲醇溶解，丙酮充分?jǐn)嚢枋蛊洚a(chǎn)生沉淀，離心，將沉淀冷凍干燥，計(jì)算提取率。然后，將粗皂苷用甲醇稀釋至1.000 mg/mL，利用高氯酸-香草醛-冰醋酸法［17］測(cè)定其在552 nm 下的吸光度，并計(jì)算皂苷含有量。

1.3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化苦瓜皂苷的浸提工藝 影響苦瓜根總皂苷提取的因素很多，根據(jù)文獻(xiàn)［15，17-19］報(bào)道的單因素試驗(yàn)及預(yù)試驗(yàn)來確定因素范圍，選擇A (浸提溫度)、B(浸提時(shí)間)、C (乙醇體積分?jǐn)?shù))、D (料液比)作為考察因素，以總皂苷含有量為指標(biāo)，對(duì)提取工藝參數(shù)進(jìn)行四因素四水平優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)方案見表1。

表1 L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.3.3 苦瓜根總皂苷抑制α-葡萄糖苷酶的測(cè)定方法 參考Feng 等［20］建立的96 微孔板試驗(yàn)法，測(cè)定最優(yōu)提取條件下總皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果。總反應(yīng)體系為240 μL，其中含0.01 mol/L、pH 為6.8 磷酸鉀緩沖液120 μL (樣品溶解在此溶液中)，加入0.8 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液20 μL (α-葡萄糖苷酶用含0.2% BSA 的0.01 mol/L、pH 為6.8 的磷酸鉀緩沖液配制)，37 ℃下恒溫反應(yīng)15 min后加入5.0 mmol/L PNPG 溶液20 μL (PNPG 用0.1 mol/L、pH 為6.8 的磷酸鉀緩沖液配制)，37 ℃下恒溫反應(yīng)15 min，再加入0.2 mol/L Na2CO3溶液80 μL，在405 nm 波長下測(cè)OD 值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。同時(shí)，制得相同體系下的樣品空白組，酶與底物用0.01 mol/L、pH 為6.8 的磷酸鉀緩沖液代替背景組、不加樣品的陰性對(duì)照組和以阿卡波糖為抑制劑的陽性對(duì)照組，并用Sigma Plot 10.0 軟件擬合非線性方程，計(jì)算IC50值。酶活性抑制率公式為酶活性抑制率= ［OD 陰性- (OD 樣品陰性- OD 樣品背景)］ /OD 陰性×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)表1 中的試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)方案，加E 誤差列，套用L16(45)正交試驗(yàn)表，以總皂苷含有量為指標(biāo)，結(jié)果見表2 和表3。通過正交試驗(yàn)來比較各因素的極差值，發(fā)現(xiàn)其大小依次為C ＞D ＞B ＞A，即影響苦瓜根總皂苷提取率的試驗(yàn)因素順序?yàn)镃 (乙醇體積分?jǐn)?shù))、D(料液比)、B (浸提時(shí)間)、A (浸提溫度)，由方差分析結(jié)果可知，這四個(gè)因素對(duì)提取效果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。綜上所述，最佳提取工藝是A1B1C3D1，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1 ∶5、浸提時(shí)間6 h、浸提溫度40 ℃。

2.2 苦瓜根總皂苷的驗(yàn)證試驗(yàn) 在上述工藝條件下，10 g苦瓜根粉平均得到的總皂苷提取物為0.23 g，得率為2.3%。經(jīng)比色分析，總皂苷含有量為0.98 mg/mL，純度達(dá)到98%，優(yōu)于陳林等［8］報(bào)道的結(jié)果。

2.3 苦瓜根總皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響 α-葡萄糖苷酶是一種存在于小腸絨毛黏膜細(xì)胞刷狀緣的酶類，可催化淀粉、麥芽糖或其他碳水化合物非還原末端的α-1，4-糖苷鍵水解，并釋放出葡萄糖酶，而其抑制劑通過可逆性或競爭性抑制小腸刷狀緣上α-葡萄糖苷酶的活性，延緩或抑制葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收，從而減緩餐后血糖的升高［21］。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

由表4 可知，苦瓜根總皂苷與陽性對(duì)照阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用均呈一定量效關(guān)系，即均隨抑制劑質(zhì)量濃度的增加而顯著上升，雖然苦瓜根總皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶有一定程度的抑制作用(IC50=1 538 μg/mL)，但活性明顯弱于阿卡波糖(IC50=454 μg/mL)。由此可知，苦瓜根總皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性相當(dāng)于阿卡波糖的1/3左右，與王琪等［8］報(bào)道的苦瓜果實(shí)皂苷的抑制活性結(jié)果相一致，推測(cè)其活性可能與皂苷的構(gòu)型有關(guān)。陳林等［3，22-23］發(fā)現(xiàn)，苦瓜根中含有三萜皂苷，其結(jié)構(gòu)中的羥基、陽離子、三角形異頭碳中心、共價(jià)連接環(huán)所形成的半椅狀或椅狀構(gòu)型，均能與酶有很好的結(jié)合能力，從而降低其活性。

表4 阿卡波糖與苦瓜根總皂苷對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以苦瓜根總皂苷的含有量為指標(biāo)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)最佳提取工藝條件為浸提溫度40 ℃、浸提時(shí)間6 h、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1 ∶5。在此條件下，總皂苷得率為2.3%，含有量為0.98 mg/mL，純度達(dá)98%，優(yōu)于王琪等［8］研究報(bào)道，推測(cè)除了供試材料的品種、地域差異、植株生產(chǎn)年限等因素外，可能還與試驗(yàn)設(shè)計(jì)的各因素水平有關(guān)。

對(duì)總皂苷進(jìn)行了α-葡萄糖苷酶的抑制活性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該條件下所得總皂苷的抑制活性均與抑制劑的質(zhì)量濃度呈正相關(guān)性，即具有劑量依賴性，因此有著較好的開發(fā)價(jià)值。雖然IC50值可較好地評(píng)價(jià)提取物的活性，但仍存在一定片面性，因此評(píng)價(jià)抑制劑活性時(shí)，應(yīng)從多方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

綜上所述，苦瓜根總皂苷具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可采用活性追蹤方法對(duì)其提取物進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化研究。

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