腎腦復(fù)元湯對腦缺血大鼠BDNF 及bFGF 表達(dá)的影響

胡國恒， 李映辰 ， 程齊來， 范金花， 陳韻羽， 張忠偉

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南長沙410007;2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長沙410208;3. 邵陽市中醫(yī)院，湖南邵陽422001;4. 鄭州市中醫(yī)院，河南鄭州450002)

缺血性中風(fēng)，是指各種原因引起的局部腦組織血液供應(yīng)障礙，導(dǎo)致腦組織缺血缺氧壞死，從而產(chǎn)生的一系列臨床神經(jīng)功能缺損綜合征［1］。在本病的治療上，除進(jìn)行超早期(發(fā)病4.5 h 內(nèi))溶栓以外，其他腦保護(hù)治療措施尚未得到公認(rèn)，臨床上也缺乏真正有效的神經(jīng)保護(hù)劑。因此如何促進(jìn)中風(fēng)后神經(jīng)功能恢復(fù)，改善患者后期生活質(zhì)量，依然是當(dāng)前醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)。研究表明，中醫(yī)藥在降低中風(fēng)后致殘率，促進(jìn)患者神經(jīng)功能恢復(fù)等方面有明顯的療效，有望為本病的腦保護(hù)治療開辟新的途徑［2］。本研究擬通過建立大腦中動脈梗死(MCAO)動物模型，從神經(jīng)功能評分、腦梗死體積測定、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)的表達(dá)等方面，探究腎腦復(fù)元湯的腦保護(hù)作用和機(jī)制，并為“從腎治腦、腎腦同治”法治療缺血性中風(fēng)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康SPF 級Sprague Dawley (SD)大鼠，雄性，體質(zhì)量為(260 ±20)g，購自湖南省斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SYXK (湘)2011-0003;動物合格證號43004700002454;動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF 級實驗動物中心，許可證號SYXK (湘)2009-0001。

1.2 藥物

1.2.1 藥物組成 腎腦復(fù)元湯:熟地黃10 g，山茱萸10 g，山藥15 g，黃芪30 g，紅景天20 g，牡丹皮10 g，當(dāng)歸尾10 g，赤芍10 g，地龍10 g，丹參10 g，川芎10 g。藥材均購自湖南省中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，并經(jīng)藥劑科鑒定為道地藥材。

1.2.2 制備方法 采用自動中藥煎藥壺(“竹水溪”ZSXQ6 型)煎藥:每劑一煎加水500 mL，煎汁200 mL;二煎加水300 mL，煎汁150 mL;2 煎混合，于水浴鍋內(nèi)蒸發(fā)濃縮至含生藥2 g/mL，4 ℃冷藏備用。

1.3 主要儀器和試劑 石蠟切片機(jī) (Reichert histo STAT)，光學(xué)顯微鏡(Olympus)，兔抗大鼠bFGF 試劑盒與兔抗大鼠BDNF 試劑盒(武漢博士德生物公司)，通用pv-9000 Kir 試劑盒(北京中杉生物公司)，甲苯胺藍(lán)(上海試劑三廠)，伊紅、蘇木精、水合氯醛等其他試劑由湖南中醫(yī)藥大學(xué)組織與胚胎學(xué)實驗室提供。

1.4 分組與給藥 用隨機(jī)數(shù)字表法將所有大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、MCAO 模型組、腎腦復(fù)元湯組，以上各組造模成功后，分為7、14、21 d 3 個亞組，每組8 只。各組于造模后24 h 開始給藥，假手術(shù)組、MCAO 模型組予蒸餾水灌胃，中藥組予腎腦復(fù)元湯灌胃。經(jīng)過預(yù)實驗，中藥劑量因素對藥效的影響無顯著性差異，故實驗中只選用臨床使用中藥劑量，即根據(jù)60 kg 成人每日服用145 g 生藥劑量進(jìn)行換算大鼠給藥劑量，公式為:大鼠劑量(g) =成人每日劑量(g) ×大鼠體質(zhì)量與體表面積比值/人體質(zhì)量與體表面積比值［3］。各組給藥體積均為20 mL/kg，中藥予蒸餾水稀釋至相應(yīng)體積灌胃，各組每日灌胃一次，直至處死。

1.5 動物造模 采用改良Zea Longa 線栓法制作大鼠MCAO 模型［4］。2 h 后拔除線栓，造成腦梗死后再灌注。術(shù)中予股動脈插管，監(jiān)測血壓(Bp)，留取標(biāo)本行血?dú)夥治黾把菣z測，整個實驗中使用恒溫墊及白熾燈照射維持大鼠體溫在(37.0 ±0.5)℃。再灌注后2 h 后采用Zea Longa［3］5 分制神經(jīng)功能評分初步評價動物造模情況，分值在1 ～3 分者入組。剔除標(biāo)準(zhǔn):評分低于1 分或超過3 分者;身體狀態(tài)極差者(如精神狀態(tài)極差，發(fā)生癲癇，重度呃逆、流涎、腹瀉等);未到時間點(diǎn)死亡者。因大鼠死亡致樣本量不足時隨機(jī)替補(bǔ)。

1.6 神經(jīng)功能缺損評價 各組大鼠在造模前24 h、造模成功后24 h、處死前采用改良大鼠神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度評分量表(m-NSS)［5］分別進(jìn)行評分:從運(yùn)動、感覺功能、平衡能力及生理反射對大鼠各項生理功能進(jìn)行等級評分，正常記0 分，異常者根據(jù)量表及嚴(yán)重程度記1 ～6 分，總分為18 分，分值越高表示神經(jīng)功能損害越嚴(yán)重。評分人員熟悉評分細(xì)則但不知曉實驗?zāi)康募昂罄m(xù)實驗內(nèi)容，各指標(biāo)評分三次取均值納入結(jié)果。

1.7 灌注取腦與包埋 大鼠予10% 水合氯醛0.35 mL/100 g腹腔注射麻醉后，剪開左前胸組織，暴露心臟，以9號注射針頭從心尖部穿刺入左心室，夾閉腹主動脈，剪開右心耳;灌注約100 mL 生理鹽水至右心耳沖出清透液體后，更換成4%多聚甲醛灌注約300 mL 斷頭取腦;取腦后，置于4%多聚甲醛內(nèi)固定，常規(guī)法脫水、透明、浸蠟、包埋。

1.8 HE 染色 取前囪后1.0 ～1.5 mm 區(qū)域冠狀切片，厚5 μm，二甲苯和無水乙醇脫蠟，蘇木精染色10 min 后自來水浸洗，1%伊紅復(fù)染3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后封片。光鏡(×400)下，各組大鼠分別選取缺血側(cè)海馬區(qū)5 個互不重疊的視野，采用IPP6.0 圖像分析系統(tǒng)，計數(shù)壞死細(xì)胞個數(shù)(胞核固縮壞死或出現(xiàn)空泡樣變性)，取5個相同單位面積的細(xì)胞數(shù)平均值納入。

1.9 腦梗死體積計算 從大鼠前囪前2 mm 處，每隔2 mm做一冠狀切片，厚10 μm，共選取4 個層面進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色。染色時，石蠟切片用二甲苯脫蠟，酒精清洗至水，1%甲苯胺藍(lán)水溶液37 ℃染3 min，自來水漂洗，95%乙醇分化，0.5%伊紅染液復(fù)染1 ～2s，二甲苯透明后封片。采用ImageJ 圖像分析軟件計算腦梗死面積(深紫色區(qū)域為正常腦組織，淺白色區(qū)域為梗死區(qū))，各腦片梗死面積乘以厚度(2 mm)為梗死體積。

1.10 免疫組化 取前囪后1.0 ～1.5 mm 區(qū)域做冠狀切片，厚5 μm，免疫組化染色進(jìn)行BDNF 及bFGF 檢測。腦片常規(guī)脫蠟、水化組織，3%過氧化氫孵育10 min，0.01 mol/L檸檬酸鹽液中100 ℃修復(fù)10 min×2 次，PBS 沖洗2 min×3次，濕盒中滴加1:100 稀釋一抗、37 ℃孵育2 h 后，分別滴加聚合物輔助劑和辣根酶標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，常規(guī)脫水、透明及封片。陰性對照滴加PBS 代替一抗。

1.11 BDNF 及bFGF 表達(dá)檢測 每組每個指標(biāo)檢測8 張切片，分別選取缺血海馬區(qū)5 個互不重疊的視野，采用IPP 6.0 軟件進(jìn)行圖像分析，測定陽性細(xì)胞的平均光密度值，取5 個視野平均值納入，光密度值高，則細(xì)胞陽性染色強(qiáng)度高。

1.12 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以(±s)表示，計量資料采用t 檢驗進(jìn)行兩組間比較，多組比較采用單因素反差分析比較，P ＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生理指標(biāo)檢測 各組大鼠在腦缺血前30 min，再灌注后30 min，平均動脈血壓BP、血液pH、PaO2、PaCO2和血糖均維持正常，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)，見表1。

表1 大鼠生理指標(biāo)檢測(±s，n=8)

表1 大鼠生理指標(biāo)檢測(±s，n=8)

/mmHg 血糖/(mg·dL -1)缺血前 再灌注 缺血前 再灌注 缺血前 再灌注 缺血前 再灌注 缺血前 再灌注假手術(shù)組 76.4 ±2.3 76.8 ±2.0 7.29 ±0.02 7.27 ±0.02 31.4 ±1.5 31.8 ±2.1 108.2 ±6.6 109.0 ±6.1 92.9 ±8.2 103.5 ±10.0模型組 77.0 ±2.5 76.7 ±2.3 7.30 ±0.03 7.28 ±0.01 31.6 ±1.7 31.2 ±1.9 108.0 ±6.0 109.2 ±6.1 94.5 ±9.9 104.7 ±10.3腎腦復(fù)元湯組 76.0 ±2.5 76.5 ±2.1 7.28 ±0.04 7.29 ±0.03 31.3 ±1.6 32.0 ±2.5 108.5 ±6.5 108.9 ±5.9 93.0 ±8.0 10組別 血壓/mmHg pH PaO2/mmHg PaCO2 4.0 ±10.2

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 大鼠腦缺血后，神經(jīng)功能明顯下降，腎腦復(fù)元湯組在持續(xù)給藥6、13、20 d 神經(jīng)功能恢復(fù)明顯優(yōu)于模型組(P ＜0.01)，見表2。

表2 不同時間點(diǎn)各組神經(jīng)功能缺損分值比較(±s，n=8)

表2 不同時間點(diǎn)各組神經(jīng)功能缺損分值比較(±s，n=8)

注:與模型組相比，★P ＜0.01

組別 給藥前 給藥當(dāng)天 給藥6 d 給藥13 d 給藥20 d假手術(shù)組 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 0.00±0.00 9.88±1.25 8.80±1.92 7.00±2.12 5.80±2.59腎腦復(fù)元湯組 0.00±0.00 9.92±1.38 6.00±1.70★4.40±1.71★3.20±1.32

2.3 HE 染色 在光鏡下對缺血區(qū)腦組織進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，假手術(shù)組海馬區(qū)細(xì)胞輪廓正常，排列緊密，胞核居中;7、14 d 時，模型組和腎腦復(fù)元湯組可見梗死區(qū)液化或者鈣化病灶，胞核固縮壞死或出現(xiàn)空泡，細(xì)胞結(jié)構(gòu)散亂、部分細(xì)胞輪廓不清，但腎腦復(fù)元湯組細(xì)胞壞死較模型組輕(P ＜0.01);21 d 時，各組細(xì)胞排列有序，輪廓清晰，模型組仍可見少量壞死細(xì)胞，明顯多于腎腦復(fù)元湯組(P ＜0.01)，見圖1，表3。

表3 壞死細(xì)胞計數(shù)比較(±s)

表3 壞死細(xì)胞計數(shù)比較(±s)

注:與模型組相比，★P ＜0.01

組別 例數(shù) 壞死細(xì)胞數(shù)，個/mm 2 7 d 14 d 21 d假手術(shù)組8 1.63 ±0.74 1.58 ±0.66 1.41 ±0.45模型組 8 31.16 ±7.26 20.22 ±4.70 5.51 ±1.02腎腦復(fù)元湯組 8 23.26 ±5.21★ 11.23 ±3.85★ 2.61 ±0.85★

2.4 大鼠腦梗死體積比較 隨著時間的延長，各組大鼠腦梗死體積逐漸縮小，且腎腦復(fù)元湯組大鼠在各時間點(diǎn)腦梗死體積均較模型組小，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義 (P ＜0.01)，見表4。

圖1 海馬區(qū)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(HE，×400)

表4 大鼠腦梗死體積比較(mm3，±s)

表4 大鼠腦梗死體積比較(mm3，±s)

注:與模型組相比，★P ＜0.01

組別 例數(shù)梗死體積7 d 14 d 21 d假手術(shù)組8 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00 0.00 ±0.00模型組 8 90.56 ±12.56 61.39 ±12.36 32.69 ±8.56腎腦復(fù)元湯組 8 71.26 ±10.25★40.65 ±9.25★ 20.05 ±6.66★

2.5 BDNF 及bFGF 表達(dá)檢測 假手術(shù)組BDNF 及bFGF 平均光密度值無明顯變化;隨著時間延長，腦缺血損傷各組BDNF 及bFGF 平均光密度值均呈不同程度降低。腎腦復(fù)元湯組BDNF 及bFGF 光密度值在各時間點(diǎn)較假手術(shù)組均有顯著差異(P ＜0.01)，BDNF 光密度值在7、14 d 較模型組有顯著差異(P ＜0.01)，bFGF 光密度值在第7 天較模型組差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)，見表5，圖2。

表5 各組大鼠BDNF 及bFGF 表達(dá)比較(±s，n=8)

表5 各組大鼠BDNF 及bFGF 表達(dá)比較(±s，n=8)

注:與模型組相比，★P ＜0.05，▲P ＜0.01

BDNF bFGF第7 天 第14 天 第21 天 第7 天 第14 天 第21 天假手術(shù)組 0.175 ±0.016 0.176 ±0.014 0.174 ±0.017 0.152 ±0.017 0.151 ±0.021 0.149 ±0.019模型組 0.195 ±0.020 0.187 ±0.018 0.176 ±0.021 0.185 ±0.023 0.170 ±0.015 0.150 ±0.022腎腦復(fù)元湯組 0.232 ±0.018▲ 0.198 ±0.016▲ 0.183 ±0.012★ 0.214 ±0.015▲ 0.190 ±0.020★ 0.171 ±0.016組別★

圖2 BDNF 及bFGF 第7 天時的表達(dá)(×400)

3 討論

缺血性中風(fēng)好發(fā)于中老年人，蓋因中年之后腎氣漸損，精水日涸，髓?？仗?，氣血生成乏源，氣虛則血滯，遂致腦絡(luò)血液凝澀不暢，發(fā)為中風(fēng)。腎為一身之根本，髓海有病，其本在腎，故治腎亦即治腦。因此腎虛血瘀也是本病重要的病機(jī)，治療本病，在活血化瘀的同時，要補(bǔ)腎生髓，從腎治腦、腎腦同治，使腎精髓旺，血活瘀祛，如此則精盛、髓滿、腦充、瘀散、絡(luò)暢、竅通。

根據(jù)從“腎治腦、腎腦同治”理論組方的腎腦復(fù)元湯是治療缺血性中風(fēng)的有效方藥，臨床應(yīng)用可明顯改善腦卒中患者的神經(jīng)功能，降低致殘率，提高生活質(zhì)量［6-7］。本方君以熟地、黃芪，熟地養(yǎng)血益陰、填補(bǔ)精髓，大劑量黃芪可峻補(bǔ)脾胃元?dú)?，氣旺則血脈通，兩者合用，益精生髓，血行瘀去;臣以山藥、山茱萸，山藥益氣養(yǎng)陰、補(bǔ)脾益腎，山茱萸補(bǔ)益肝腎、兼能澀精，合熟地更增補(bǔ)養(yǎng)肝腎之功效，取“肝腎同源”之意;佐以大隊活血通絡(luò)之品，牡丹皮、赤芍清熱涼血、活血祛瘀，兼制山萸肉之溫澀，紅景天、當(dāng)歸尾補(bǔ)血通絡(luò)、活血止痛，且有化瘀而不傷血之妙;使以地龍，引藥入經(jīng)，通經(jīng)祛瘀;全方共奏益腎補(bǔ)氣活血通絡(luò)之功。

BDNF 及bFGF 同屬神經(jīng)營養(yǎng)因子家族，在腦缺血損傷修復(fù)過程中起著重要的作用。BDNF 在大腦皮層及海馬區(qū)含量較多，腦缺血再灌注損傷可以誘導(dǎo)其表達(dá)，從多個方面減少炎癥損傷和細(xì)胞凋亡。BDNF 可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+結(jié)合蛋白表達(dá)、穩(wěn)定Ca2+濃度，抑制一氧化氮合酶的產(chǎn)生、減少自由基生成，下調(diào)Bax/Bcl 表達(dá)、抑制β-淀粉樣蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［8］;腦缺血后，BDNF 還可以通過與其特異性trkB 受體相結(jié)合，增加神經(jīng)突觸可塑性，促進(jìn)軸突生長，改善腦組織修復(fù)［9］。bFGF 屬于FGF 家族，是一種廣譜的促神經(jīng)生長因子和促神經(jīng)細(xì)胞分裂因子，但正常情況下腦組織內(nèi)含量較少［10］。腦缺血發(fā)生后，bFGF 表達(dá)明顯增加，其可以通過特異性提高caspase-3 基因、降低Bcl-2 基因的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖和血管新生，并抑制神經(jīng)元凋亡，減少再灌注損傷;另外，bFGF 還能通過結(jié)合其特異性受體，激活酪氨酸激酶，增加NO 釋放，擴(kuò)張局部血管，改善微循環(huán)和細(xì)胞代謝，拮抗腦組織缺血缺氧損傷［11］。

本研究結(jié)果表明，與模型組相比，腎腦復(fù)元湯可以明顯改善腦缺血再灌注大鼠運(yùn)動和感覺神經(jīng)功能，并促進(jìn)腦梗死組織修復(fù);在神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)方面，腎腦復(fù)元湯可以明顯提高BDNF 及bFGF 的表達(dá)。因此，腎腦復(fù)元湯可能是通過促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖和血管新生，減少細(xì)胞凋亡，抑制缺血再灌注損傷，以發(fā)揮其“腦保護(hù)”作用。實驗中，大鼠術(shù)前及術(shù)后各項血液生化指標(biāo)(BP、pH、PaO2、PaCO2和血糖)均維持正常范圍，未出現(xiàn)由藥物引起的明顯不良反應(yīng)，證明了腎腦復(fù)元湯在動物實驗中的安全性。因此，本實驗從動物實驗角度證實了腎腦復(fù)元湯治療缺血性中風(fēng)安全有效，初步揭示了其作用靶點(diǎn)，并為中醫(yī)藥“從腎治腦、腎腦同治”法治療中風(fēng)提供了實驗依據(jù)。

［1］ 賈建平. 神經(jīng)病學(xué)［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2011.

［2］ 張本超. 通心絡(luò)膠囊治療130 例腦梗死療效觀察［J］. 中醫(yī)臨床研究，2011，3(22):70-71.

［3］ 翁維良. 中藥臨床藥理學(xué)［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2002.

［4］ Lin Y C，Ko T L，Shih Y H，et al. Human umbilical mesenchymal stem cells promote recovery after ischemic stroke［J］.Stroke，2011，42(7):2045-2053.

［5］ Zhang L，Li Y，Zhang C，et al. Delayed administration of human umbilical tissue-derived cells improved neurological functional recovery in a rodent model of focal ischemia［J］. Stroke，2011，42(5):1437-1444.

［6］ 范金茹. 王行寬議案精華［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2014.

［7］ 張忠偉，胡國恒. 腎腦復(fù)原湯治療腦梗死恢復(fù)期腎虛血瘀證30 例療效觀察［J］. 湖南中醫(yī)雜志，2014，30(4):11-13.

［8］ 黃 文，莫雪安，張 成，等. BDNF 體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對腦缺血大鼠神經(jīng)缺失功能的作用［J］. 廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，29(6):821-824.

［9］ Zhang Y，Pardridge W M. Blood-brain barrier targeting of BDNF improves motor function in rats with middle cerebral artery occlusion［J］. Brain Res，2006，11(11):227-229.

［10］ Sonmez A B，Castelnuovo J. Applications of basic fibroblastic growth factor (FGF-2，bFGF)in dentistry［J］. Dent Traumatol，2014 ，30(2):107-111.

［11］ Jaipersad A S，Lip G Y，Silverman S，et al. The role of monocytes in angiogenesis and atherosclerosis［J］. J Am Coll Cardiol，2014，63(1):1-11.