白花蛇舌草注射劑抑制人肝癌細胞SMMC-7721 增殖及調(diào)控Bcl-2/CytC信號通路誘導(dǎo)線粒體凋亡

李文婷， 趙鳳鳴， 戴紫函， 周 韜， 李沐涵， 吳勉華*

(1. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京210023;2. 愛丁堡大學(xué)生物科學(xué)學(xué)院，英國EH9 3JR)

肝癌為常見的惡性腫瘤之一且在我國發(fā)病率較高，其病因迄今尚未闡明。肝癌目前以手術(shù)治療、放療、局部消融療法、化療等綜合治療，但整體預(yù)后仍不良?，F(xiàn)代研究資料表明中草藥白花蛇舌草具有抗腫瘤、抗氧化、抗菌、增強非特異性免疫和保護神經(jīng)系統(tǒng)的作用。近年來因其在惡性腫瘤和炎性疾病中的顯著效果［1］被廣泛應(yīng)用于臨床，受到醫(yī)藥工作者的重視。實驗證明白花蛇舌草對多種腫瘤細胞具有抑制生長和誘導(dǎo)凋亡的作用，如人膠質(zhì)母細胞瘤U87 細胞［2］、多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8226 細胞［3］、人乳腺癌MCF-7 細胞［4］、腹水瘤S180 細胞［5］等。李潔［6］等體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草處理小鼠血道轉(zhuǎn)移模型后，對腫瘤細胞血道轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性。劉智勤［7］等報道白花蛇舌草聯(lián)合氟尿嘧啶5-Fu 作用于H22 荷瘤小鼠后，調(diào)節(jié)荷瘤小鼠胃腸和免疫功能，起到減毒增效的功能。

白花蛇舌草注射液作用于體內(nèi)、體外均有良好的抗腫瘤效果，但其對肝癌的作用機制研究尚不明確。本實驗選擇人肝癌SMMC-7721 細胞作為研究對象，探討白花蛇舌草對人肝癌SMMC-7721 細胞增殖凋亡及Bcl-2/CytC 信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 白花蛇舌草注射液購自吉林省通化振國藥業(yè)有限公司，(國藥準字Z22022101，產(chǎn)品批號130201，規(guī)格為每支裝2 mL);注射用順鉑購自齊魯制藥(海南)有限公司(國藥準字H20073652，產(chǎn)品批號1A1A1306026B，規(guī)格10 mg);DMEM/HIGH GLUCOSE 培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液均購自Gibco 公司;胰酶、噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)購自Biosharp 公司;磷酸鹽緩沖液 (PBS)購自Hyclone 公司;一抗Bax、Bcl-2、Caspase-3、CytC、β-actin 均購自Cell Signaling 公司，羊抗兔IgG 二抗購自Santa 公司。MTT 用PBS 溶液配制成濃度是5 mg/mL，4 ℃避光保存于冰箱，1 周棄用。

1.2 方法

1.2.1 細胞株及細胞培養(yǎng) 人肝癌細胞株SMMC-7721 購自南京凱基生物公司。將SMMC-7721 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 μg/mL 的青鏈霉素混合液的DMEM 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、體積分數(shù)5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隔天換液，0.25%胰酶消化，調(diào)整細胞密度為1 ×105個/mL。取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 噻唑藍還原法(MTT 法)檢測白花蛇舌草注射液對細胞增殖的影響 將SMMC-7721 細胞以每孔180 μL 接種于96 孔板中，加入白花蛇舌草注射液20 μL，終濃度分別為0 (空白對照)、25、50、100 μg/mL，陽性對照組加入順鉑20 μL，終濃度為4 μg/mL，每個藥物濃度組各設(shè)6 個復(fù)孔。置于37 ℃，5% CO2及飽和濕度條件下細胞培養(yǎng)箱中孵育24、48 h 后加入5 mg/mL MTT 溶液20 μL，振蕩2 min 混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄孔內(nèi)試劑，每孔加DMSO 150 μL，吸棄試劑，加入DMSO 溶液150 μL，輕輕振蕩10 min，充分混勻后，放入酶標儀中，選取490 nm 波長測定每孔吸光度(OD)值。調(diào)零孔為200 μL DMEM 培養(yǎng)液。計算細胞增殖抑制率IR(%) =［1-(OD處理組-OD調(diào)零孔)/(OD空白對照組-OD調(diào)零孔)］×100%。

1.2.3 倒置顯微鏡觀察結(jié)果 使用終濃度分別為0 (空白對照)、25、50、100 μg/mL 白花蛇舌草注射液及4 μg/mL順鉑作用于人肝癌SMMC-7721 細胞24 h 后，倒置顯微鏡下對每組SMMC-7721 細胞形態(tài)進行觀察。

1.2.4 透視電鏡觀察結(jié)果 取對數(shù)生長期細胞加入白花蛇舌草注射液，使其終濃度為100 μg/mL，空白組加入DMEM 培養(yǎng)液后，放置于37 ℃，體積分數(shù)5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h 后，胰酶消化，1 000 r/min 離心10 min，去上清后沿離心管壁緩慢加入0.25%戊二醛固定。乙醇脫水后，采用LR White 包埋，切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后，觀察其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。

1.2.5 Western blot 法檢測蛋白表達 將4 組(0、25、50、100 μg/mL)白花蛇舌草注射液和1 組4 μg/mL 順鉑分別作用細胞24 h 后，低溫提取蛋白，蛋白定量，加入4 ×loading buffer，100 ℃變性5 min。采用12%的SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉置于搖床上室溫封閉1 h，一抗按照1 ∶1 000 濃度在4 ℃中孵育過夜，TBST 洗膜3 次，各10 min，二抗按照1 ∶3 000 濃度配置，搖床上室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，每次15 min，滴入ECL 顯色劑，避光顯色1 min 后放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光，實驗重復(fù)3 次。

1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(±s)表示。樣本比較采用單因素方差分析(One way ANOVA)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草注射液對SMMC-7721 作用 白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721 細胞24、48 h 后，細胞存活率在50、100 μg/mL 濃度下顯著下降。抑制率隨藥物濃度的增加和作用時間的延長而升高，呈現(xiàn)劑量和時間依賴關(guān)系，見表1。白花蛇舌草注射液在50 μg/mL 和100 μg/mL 濃度時對SMMC-7721 細胞具有明顯的抑制作用(P ＜0.05)。本研究發(fā)現(xiàn)在25 μg/mL 濃度下白花蛇舌草注射液組具有促腫瘤增殖趨勢。有文獻報道具有抗腫瘤作用中藥，在某些濃度下存在促進腫瘤生長作用。陳坤［8］等人報道一定體積分數(shù)的黃芪注射液具有促進人食管癌細胞珠TE-B 生長作用。本研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草亦存在此現(xiàn)象，表明中藥的使用上應(yīng)注意其濃度，以充分發(fā)揮其抗腫瘤作用。

表1 白花蛇舌草注射液對人肝癌細胞增殖的影響(±s，n=3)

表1 白花蛇舌草注射液對人肝癌細胞增殖的影響(±s，n=3)

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05

組別 質(zhì)量濃度/(μg·mL -1 OD 值/(×10 -1抑制率/%24 h 48 h 24 h 48 h空白對照組 0 3.45 ±0.23 4.72 ±0.11 - -順鉑組 4 1.19 ±0.14* 0.88 ±0.15* 65.507 81.356白花蛇舌草注射液組 100 1.05 ±0.05* 0.97 ±0.13* 69.543 79.396白花蛇舌草注射液組 50 2.46 ±0.47* 2.59 ±0.13* 28.716 45.127白花蛇舌草注射液組 25 4.33 ±0.06* 6.25 ±0.21*))-25.526 -32.468

2.2 白花蛇舌草注射液對SMMC-7721 細胞形態(tài)的影響 不同劑量白花蛇舌草注射液作用后細胞形態(tài)存在差異，如圖1。

由圖1A 圖可見空白對照組SMMC-7721 細胞形態(tài)呈現(xiàn)多邊形或類三角型，緊密排列，胞質(zhì)較透明。不同濃度(25、50、100 μg/mL)的白花蛇舌草注射液處理后，隨著藥物濃度的增加，細胞密度明顯降低，數(shù)目減少，形態(tài)變得不規(guī)則。4 μg/mL 順鉑處理細胞后，細胞形態(tài)不規(guī)則，脫落，漂浮的細胞碎片增多。由圖1D 圖可見細胞出現(xiàn)萎縮、漂浮，細胞碎片增多，細胞膜邊緣出現(xiàn)空泡等凋亡形態(tài)改變。圖1E 細胞數(shù)目減少明顯，可見大量脫壁、漂浮的細胞。由圖可見100 μg/mL 白花蛇舌草注射液與4 μg/mL 順鉑作用于SMMC-7721 細胞后抑制細胞生長作用最為明顯。

2.3 白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721 細胞超微結(jié)構(gòu)變化由圖2A 圖可見，空白對照組細胞核較大，細胞核清晰，細胞器豐富，線粒體呈圓形或橢圓形，基質(zhì)豐富，細胞核內(nèi)染色質(zhì)分布均勻。由圖2B 可見白花蛇舌草注射液劑量為100 μg/mL 時，微絨毛脫落，胞質(zhì)變性，出現(xiàn)空泡，細胞染色質(zhì)固縮，邊移，存在早期凋亡跡象。

2.4 白花蛇舌草注射液調(diào)控SMMC-7721 細胞Bcl-2/CytC 信號通路相關(guān)蛋白表達 Western blot 結(jié)果顯示由圖3 可見，100、50、25 μg/mL 白花蛇舌草注射液預(yù)處理細胞24 h，與對照組相比Bax、CytC、Caspase-3 蛋白表達逐漸加深，Bcl-2 蛋白表達逐漸減弱。Bcl-2/Bax 比值降低。其中100、50 μg/mL組效果最顯著。提示白花蛇舌草注射液能上調(diào)人肝癌SMMC-7721 細胞Bax 蛋白表達，下調(diào)Bcl-2 蛋白的表達，降低Bcl-2/Bax 比值，釋放CytC，激活Caspase-3 蛋白的表達，誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，見表2。

3 討論

肝癌為常見的惡性腫瘤，其病程發(fā)展快，病人存活期短，預(yù)后多不良。我國屬肝癌的高發(fā)地區(qū)，肝癌死亡率約占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。目前對肝癌的治療以手術(shù)和化療為主的綜合治療，但大劑量化療藥物的毒副反應(yīng)使得病人的生存質(zhì)量很差［9］。近年來，中醫(yī)藥抗腫瘤方面表現(xiàn)出的成效，使得人們將希望寄托在尋找副作用小且效果好的中藥，因此尋找治療肝癌的有效中成藥顯得十分迫切和有意義［10］。白花蛇舌在臨床廣泛使用，因其顯著療效，逐漸成為研究熱點。本實驗顯示50、100 μg/mL 的白花蛇舌草注射液表現(xiàn)出抑制人肝癌SMMC-7721 細胞增殖的能力，且隨著藥物濃度的升高和時間的延長，抑制作用逐漸增強，呈現(xiàn)出劑量時間依賴性。

圖1 各組SMMC-7721 細胞24 h 后形態(tài)學(xué)的變化(×400)

圖2 電鏡下觀察各組人肝癌細胞超微結(jié)構(gòu)變化

圖3 各組Bax，Bcl-2，Caspase-3 和CytC 蛋白表達水平

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h 后Bax、Bcl-2、Caspase-3和CytC 蛋白表達的影響(±s，n=3)

表2 白花蛇舌草注射液作用24 h 后Bax、Bcl-2、Caspase-3和CytC 蛋白表達的影響(±s，n=3)

注:與空白對照組比較，* P ＜0.05

組別 質(zhì)量濃度/(μg·mL-1)Bax/β-actin Bcl-2/β-actin Caspase-3/β-actin Cyt-c/β-actin空白對照組0 0.35±0.03 0.22±0.02 0.07±0.01 0.12±0.04白花蛇舌草注射液組 100 0.56±0.02* 0.04±0.03* 0.17±0.02* 0.52±0.02*白花蛇舌草注射液組 50 0.48±0.03* 0.11±0.02* 0.09±0.02* 0.33±0.03*白花蛇舌草注射液組 25 0.34±0.04* 0.20±0.04* 0.22±0.04* 0.51±0.02*順鉑組 4 0.75±0.02* 0.18±0.04* 0.18±0.02* 0.42±0.03*

多數(shù)抗腫瘤藥物以抑制腫瘤細胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。形態(tài)學(xué)的改變可以直觀發(fā)現(xiàn)藥物處理后腫瘤細胞的變化［11］，本實驗中白花蛇舌草注射液處理SMMC-7721 細胞后細胞出現(xiàn)萎縮、碎片、小氣泡等凋亡形態(tài)改變，且存在劑量時間依賴性。透射電鏡下可見白花蛇舌草注射液100 μg/mL 時，細胞出現(xiàn)微絨毛脫落，胞質(zhì)變性，空泡，染色質(zhì)固縮邊移等早期凋亡跡象。本研究結(jié)果提示白花蛇舌草注射液可以通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用。

細胞凋亡的途徑主要有兩條:外部途徑稱死亡受體通路，內(nèi)部途徑稱線粒體通路，是以線粒體為核心介導(dǎo)細胞凋亡。線粒體信號通路調(diào)控細胞凋亡的作用十分明顯［12］。線粒體作為第二主要功能的細胞器，參與細胞能量代謝并通過呼吸鏈作用生成ATP，與DNA 損傷、細胞衰老、細胞死亡等有關(guān)［13］。Bcl-2 家族在線粒體凋亡途徑的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Bcl-2 家族包括以Bcl-2、Bcl-xL 為代表的抑制凋亡蛋白和以Bax、Bim 為代表的促進凋亡蛋白。這兩類相反的蛋白質(zhì)相互作用，可通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)信號傳遞系統(tǒng)，調(diào)節(jié)細胞凋亡［14］。Bcl-2 表達量減少，Bax 表達量增高，，則Bcl-2/ Bax 比值降低，，則細胞容易發(fā)生凋亡。目前，Bcl-2 家族成員凋亡的機制可能有:(1)Bax 可以破壞線粒體膜，引起細胞色素C (Cytochrome C，CytC)的釋放，CytC 與凋亡蛋白酶活化因子(Apoptotic protease-activating factor，Apaf-1)結(jié)合成為多聚復(fù)合體從而激活Caspase-9，進一步強化了Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase-3，最終導(dǎo)致細胞凋亡［15］，而在細胞凋亡時Bcl-2的作用則與之相反; (2)在Bax 家族中，有抗凋亡蛋白，如:Bcl-2、Bcl-xL 與Bax 和Bcl-xL 與Bak 相互作用后可阻止Bax 或Bak 發(fā)生構(gòu)象改變抑或阻止它們的寡聚化作用抑或阻止它們插入線粒體外膜，從而抑制細胞凋亡。線粒體凋亡通路在細胞凋亡中的作用至關(guān)重要，因此選擇此通路進行研究。本研究發(fā)現(xiàn)白花蛇舌草注射液作用SMMC-7721細胞24 h 后可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達，下調(diào)抑凋亡蛋白Bcl-2 的表達，Bcl-2/Bax 比值降低，釋放CytC 蛋白，最終激活Caspase-3 蛋白，從而誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡，發(fā)揮體外抗腫瘤作用。

綜上所述，白花蛇舌草注射液對人肝癌SMMC-7721 細胞有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。其作用機制可能與其調(diào)控Bcl-2/Cytc 線粒體凋亡信號通路相關(guān)。

［1］ 紀寶玉，范崇慶，裴莉昕，等. 白花蛇舌草的化學(xué)成分及藥理作用研究進展［J］. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2014，20(19):235-240.

［2］ Zhang Y，Xie R F，Xiao Q G，et al. Hedyotis diffusa Willd extract inhibits the growth of human glioblastoma cells by inducing mitochondrial apoptosis via AKT/ERK pathways［J］. J Ethnopharmacol，2014，158(10):404-411.

［3］ 張 翔，周郁鴻，葉寶東，等. 白花蛇舌草注射液對多發(fā)性骨髓瘤細胞株增殖的抑制作用［J］. 中醫(yī)雜志，2013，54(15):1319-1326.

［4］ Liu Z，Liu M，Liu M，Li J ，et al. Methylanthraquinone from Hedyotis diffusa WILLD induces Ca2+-mediated apoptosis in human breast cancer cells［J］. Toxicol In Vitro，2010，24(1):142-147.

［5］ 陳 玉，馮大剛，胡 榮，等. 半枝蓮和白花蛇舌草總多糖對S180荷瘤小鼠的抗腫瘤作用研究［J］. 新中醫(yī)，2013，45(5):171-174.

［6］ 李 潔，孫 靜，宋 健. 白花蛇舌草抗肝癌H22 小鼠血道轉(zhuǎn)移的實驗研究［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2012，10(1):2434-2435.

［7］ 劉智勤，陳鵲汀，朱惠學(xué)，等. 白花蛇舌草對5-Fu 的增效減毒作用研究［J］. 時珍國醫(yī)國藥，2011，22 (1):142-144.

［8］ 陳 坤，高獻書，盧付河，等. 黃芪、參芪促腫瘤生長作用的觀察［J］. 河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，25(1):33-34.

［9］ 周際昌. 實用腫瘤內(nèi)科學(xué)［M］. 北京:人民衛(wèi)生出版社，2010:611-617.

［10］ Zhou J，Zhou T，Jiang M ，et al. Research progress on synergistic anti-tumor mechanisms of compounds in Traditional Chinese Medicine［J］. J Tradit Chin Med，2014，34 (1):100-105.

［11］ Mahassni S H，Al-Reemi R M. Apoptosis and necrosis of human breast cancer cells by an aqueous extract of garden cress (Lepidium sativum)seeds［J］. Saudi J Biol Sci，2013，20(2):131-139.

［12］ Chaudhary P，Vishwanatha J K. c-Jun NH2-terminal kinase-induced proteasomal degradation of c-FLIPL/S and Bcl2 sensitize prostate cancer cells to Fas-and mitochondria-mediated apoptosis by tetrandrine［J］. Biochem Pharmacol，2014，91 (4):457-473.

［13］ Gao C，Ding Y，Zhong L，et al. Tacrine induces apoptosis through lysosome- and mitochondria-dependent pathway in HepG2 cells［J］. Toxicol In Vitro ，2014，28(4):667-674.

［14］ 於丙寅，孫 偉，涂 玥，等. 中藥調(diào)控Bcl-2/Bax 信號通路干預(yù)腎臟固有細胞凋亡研究進展［J］. 河南中醫(yī)，2014，34(6):1197-1199.

［15］ Zorofchian Moghadamtousi S，Karimian H，Rouhollahi E，et al.Annona muricata leaves induce G1 cell cycle arrest and apoptosis through mitochondria-mediated pathway in human HCT-116 and HT-29 colon cancer cells［J］. J Ethnopharmacol，2014，156(10):277-289.