HPLC 法同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地、采收期、部位廣東紫珠中的熊果酸和齊墩果酸

房海靈， 聶 韡， 盧艷花， 朱培林*

(1. 江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌330032;2. 華東理工大學(xué)，上海200237)

廣東紫珠Callicarpa kwangtungensis Chun. 為馬鞭草科紫珠屬多年生落葉灌木植物［1］，以干燥莖枝和葉入藥，在我國(guó)用藥歷史相對(duì)較短，以“萬(wàn)年青”之名始載于清代《植物名實(shí)圖考》［2］，被《中國(guó)藥典》2010 年版收載［3］，具有收斂止血、散瘀、清熱解毒之功效，臨床上常用于治療宮頸糜爛出血、陰道炎、宮頸炎等癥［4］。研究表明，廣東紫珠的主要化學(xué)成分為黃酮、苯乙醇苷、萜類及揮發(fā)油等［5-8］，其中三萜類化合物(如熊果酸、齊墩果酸等)具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗氧化和降血糖等藥理作用［9］，屬于活性物質(zhì)，與該植物的主要功效相符，因而有必要對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)該藥材質(zhì)量的研究主要集中在苯乙醇苷類化合物含有量的測(cè)定方面［10-11］，鮮有三萜類化合物測(cè)定的相關(guān)報(bào)道［12］。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法，對(duì)不同產(chǎn)地、采收期、部位廣東紫珠中熊果酸和齊墩果酸的含有量進(jìn)行測(cè)定，為全面控制其質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters 2695 HPLC 色譜儀，包括真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、Waters 2468 紫外光檢測(cè)器、Empower 色譜工作站(美國(guó)Waters 公司)。熊果酸(批號(hào)110742-200518，純度95%)、齊墩果酸(批號(hào)110709-200505，純度95%)對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院)。各批次藥材經(jīng)江西省林業(yè)科學(xué)院森林藥材與食品研究所朱培林研究員鑒定，均為廣東紫珠C. kwangtungensis 的地上部分。甲醇為色譜純(德國(guó)Merck 公司);水為超純水(自制);其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 ZOBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液(90∶10);體積流量1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;柱溫25 ℃;進(jìn)樣量20 μL。理論塔板數(shù)按熊果酸峰計(jì)算，不低于5 000。在此色譜條件下，樣品中熊果酸和齊墩果酸能達(dá)到基線分離，見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品和供試品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.2 樣品制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取熊果酸、齊墩果酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成對(duì)照品母液。再分別吸取母液適量，置于同一量瓶中，加甲醇定容，得到質(zhì)量濃度分別為52.40、55.36 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取干燥至恒定質(zhì)量的廣東紫珠粉末(過(guò)100 目篩)1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇40 mL，稱定質(zhì)量，冷浸4 h，超聲(150 W、40 kHz)40 min，放冷，乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻。過(guò)濾后，藥渣按相同方法重復(fù)提取2 次，合并濾液，濃縮，乙醇定容至40 mL，0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1、4、8、16、20 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得到熊果酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y =436 428X -18 545 (r =0.999 8);齊墩果酸為Y =469 748X -18 730 (r =0.999 8)。結(jié)果表明，兩者分別在0.052 4 ～1.048、0.055 ～1.107 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5 次，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定各對(duì)照品峰面積。結(jié)果，熊果酸、齊墩果酸峰面積RSD (n=5)分別為0.3%、0.6%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取江西井岡山產(chǎn)廣東紫珠粉末5 份，每份1.0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，熊果酸、齊墩果酸峰面積RSD 分別為0.8%、0.9%，表明該方法具有較好的重復(fù)性。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取江西井岡山產(chǎn)廣東紫珠粉末1.0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積。結(jié)果，熊果酸、齊墩果酸峰面積RSD 分別為0.8%、0.7%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取各成分含有量已知的江西井岡山產(chǎn)廣東紫珠粉末5 份，每份0.5 g，精密加入含熊果酸0.43 mg、齊墩果酸0.265 mg 的乙醇溶液40 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Result of recovery tests

2.8 樣品測(cè)定 分別取不同產(chǎn)地、采收期、部位的廣東紫珠粉末適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取20 μL，注入HPLC 色譜儀，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見(jiàn)表2 ～4。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)考察了不同提取溶劑 (45%、70%、100%乙醇，50%、100% 甲醇)以及水浴回流、索氏、超聲等不同提取方法，發(fā)現(xiàn)乙醇提取的效果最佳。同時(shí)，還考察了以乙醇為提取溶劑，在不同提取時(shí)間 (40、50、60 min)、料液比 (1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50)、溫度 (50、60、70 ℃)、次數(shù)(1、2、3 次)時(shí)的提取效果。結(jié)果表明，以乙醇為提取溶劑、料液比1 ∶40、在60 ℃下超聲40 min、提取兩次時(shí)，提取較完全，而且該方法穩(wěn)定、重復(fù)性好。

在流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇方面，張光賢［15］報(bào)道了采用HPLC 法(流動(dòng)相為甲醇-1.0% 冰醋酸水溶液)進(jìn)行定量測(cè)定，但分離度不理想。本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液這3 個(gè)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)以甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)，所得色譜峰峰形較好，分離效果最佳。同時(shí)，還考察了該流動(dòng)相的3 個(gè)比例(95 ∶5、90 ∶10、82 ∶18)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)其比例為90 ∶10時(shí)，在20 min 內(nèi)出峰，保留時(shí)間合適，分離效果理想。因此，選擇甲醇-0.1% 磷酸水溶液(90 ∶10)作為流動(dòng)相。

表2 不同產(chǎn)地廣東紫珠的測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.2 Determination result of C.kwangtungensis from different growing areas (n=3)

表3 不同采收期廣東紫珠的測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.3 Determination result of C. kwangtungensis in different picking times (n=3)

表4 廣東紫珠不同部位的測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.4 Determination result of C. kwangtungensis in different parts (n=3)

熊果酸與齊墩果酸為同分異構(gòu)體，在天然植物中往往共生互存，結(jié)構(gòu)與性質(zhì)極其相似，故分離測(cè)定較為困難。早期研究采用薄層掃描色譜法測(cè)定［13］，但是易受操作環(huán)境及手法等因素影響，導(dǎo)致定量分析結(jié)果有所偏差。為此，本實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)［12，14-15］的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際情況，建立了同時(shí)測(cè)定廣東紫珠中熊果酸和齊墩果酸含有量的方法，為系統(tǒng)評(píng)價(jià)該植物的質(zhì)量提供理論依據(jù)。通過(guò)對(duì)17 個(gè)產(chǎn)地藥材中這兩種成分含有量的分析，發(fā)現(xiàn)均以熊果酸為高，約為齊墩果酸的1.5 ～2.5 倍，相差較大。因此，應(yīng)注意提高藥材內(nèi)在性質(zhì)的穩(wěn)定性，保證臨床用藥的安全性和有效性。

同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)還測(cè)定了江西蘆溪6 月至11 月廣東紫珠中熊果酸和齊墩果酸的含有量。結(jié)果表明，在該植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段，兩者存在顯著性差異，其含有量的動(dòng)態(tài)積累存在一個(gè)由高到低的趨勢(shì)，并且在9 月份最高。另外，又比較了該藥材不同部位中兩者的含有量，發(fā)現(xiàn)在果實(shí)中最高，而在根中最低。因此，該方法可應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)中，并根據(jù)不同的生產(chǎn)目的對(duì)植物原料進(jìn)行采收，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和參考價(jià)值。

［1］ 中國(guó)科學(xué)院《中國(guó)植物志》編輯委員會(huì). 中國(guó)植物志:第65 卷［M］. 北京:科學(xué)出版社，1982:74.

［2］ 清·吳其浚. 植物名實(shí)圖考［M］. 上海:商務(wù)印書(shū)館，1957:205.

［3］ 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì). 中華本草:第7冊(cè)［M］. 上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999:801.

［4］ 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典:2010 年版一部［S］. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:40.

［5］ 周伯庭，李新中，徐平聲，等. 廣東紫珠地上部位化學(xué)成分研究(Ⅰ)［J］. 中南藥學(xué)，2004，2(4):238-239.

［6］ Xie E L，Zhou G P，Ji T F，et al. A novel phenylpropanoid glycoside from Callicarpa kwangtungensis Chun. ［J］. Chin Chem Lett，2009，20:827-829.

［7］ 陳艷華，馮 鋒，任冬春，等. 廣東紫珠地上部分的化學(xué)成分［J］. 中國(guó)天然藥物，2008，6(2):120-122.

［8］ 賈 安，楊義芳，孔德云，等. 廣東紫珠超臨界提取物的GC-MS 成分分析及體外抗菌活性［J］. 中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012，43(3):178-181.

［9］ 熊 斌，雷志勇，陳 虹. 熊果酸藥理學(xué)的進(jìn)展［J］. 國(guó)外醫(yī)學(xué):藥學(xué)分冊(cè)，2004，6(31):133-136.

［10］ 周國(guó)平，謝二磊，盛杰曹，等. HPLC 法同時(shí)測(cè)定江西不同產(chǎn)地廣東紫珠藥材中連翹酯苷B 和金石蠶苷的含量［J］.藥物分析雜志，2008，28(10):1623-1625.

［11］ 劉燦黃，劉塔斯，羅晨曲，等. 廣東紫珠不同產(chǎn)地、不同部位中連翹酯苷B 和金石蠶苷含量的測(cè)定［J］. 中國(guó)中藥雜志，2013，38(19):3324-3326.

［12］ 張光賢，蔡其輝，田宏現(xiàn)，等. RP-HPLC 法測(cè)定廣東紫珠中熊果酸、齊墩果酸的含量［J］. 中華醫(yī)學(xué)實(shí)踐雜志，2007，6(8):721-722.

［13］ 許鳳鳴，王兆全，朱 元. 薄層掃描法測(cè)定消渴康顆粒中熊果酸的含量［J］. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，1998，4(4):51-52.

［14］ 麻秀萍，蔣朝暉，丁 寧，等. HPLC 測(cè)定馬鞭草中熊果酸的含量［J］. 中成藥，2005，27(1):88-90.

［15］ 徐 君，吳連花，徐文芬，等. HPLC 法測(cè)定對(duì)坐葉藥材中齊墩果酸和熊果酸［J］. 中成藥，2012，34(4):765-767.