HPLC 波長切換法測定主產(chǎn)區(qū)與道地產(chǎn)區(qū)牡丹皮中的4 種成分

張 偉， 劉信秋， 吳德玲* ， 金傳山， 方成武， 趙宏蘇， 劉頸松，許鳳清

(1. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥230031;2. 安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，安徽 合肥230031;3. 安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物化學(xué)研究所，安徽合肥230031;4. 亳州市華佗中醫(yī)院，安徽亳州236800)

牡丹皮為芍藥科植物鳳丹Paeonia ostii T. Hong et J. X. Zhang 的干燥根皮，其性微寒，味苦、辛，具有清熱涼血，活血化瘀之功效［1-2］，主產(chǎn)于安徽銅陵、南陵、亳州，山東菏澤，重慶墊江、灌縣，四川等地?，F(xiàn)代研究表明，牡丹皮中主要含有丹皮酚、酚苷類、單萜及其苷類成分，另外還有三萜、甾醇、黃酮、有機(jī)酸、香豆素等［3-6］。

目前，銅陵產(chǎn)“鳳丹皮”是傳統(tǒng)道地藥材，但目前市場上流通量最大、最常用的為亳州丹皮［7］。牡丹皮作為新引入亳州的中藥材是否值得推廣，不僅要看它的適應(yīng)情況和產(chǎn)量，更要關(guān)注其質(zhì)量，以引導(dǎo)該藥材的合理種植和優(yōu)質(zhì)生產(chǎn)。前期人們已對不同產(chǎn)地［8-10］、年限［11］、部位牡丹皮有效成分的含有量進(jìn)行過相關(guān)報道，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地該藥材的質(zhì)量有一定差異，并且同一產(chǎn)地不同生長年限其質(zhì)量也有所不同［12-16］，其中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚是牡丹皮中的主要代表性成分和活性物質(zhì)［3-4］。因此，本實驗以這4 種成分為指標(biāo)，考察亳州、銅陵不同年限牡丹皮中有效成分的含有量，以比較目前市場上主產(chǎn)區(qū)與道地產(chǎn)區(qū)該藥材的差異性。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260 HPLC 色譜儀 (包括G1316A 柱溫箱、G1329B 自動進(jìn)樣器、VWD 檢測器檢測器、ChemStation 色譜工作站)、ZORBAX SB-C18色譜柱(美國Agilent 公司);AUW220D 電子天平(十萬分之一，日本島津公司);AS3120超聲波清洗器(120 W、40 KHz，天津奧特塞恩斯儀器有限公司)

1.2 材料

1.2.1 對照品 沒食子酸(批號110831-201204，中國食品藥品檢定研究院，純度為98%);氧化芍藥苷(批號120317，成都普菲德生物技術(shù)有限公司，純度≥98%);芍藥苷(批號110736-201337，中國食品藥品檢定研究院，純度為95%);丹皮酚(實驗室自制，純度為98%)。甲醇為色譜純(美國Tedia 公司);水為娃哈哈純凈水;其余試劑均為分析純。

1.2.2 樣品 銅陵丹皮于2013 年10 月上旬采自北京同仁堂銅陵金鳳鄉(xiāng)丹皮種植基地，不同年限(3、4、5 年)各采3 棵;亳州丹皮于2013 年10月中旬采自亳州十八里中藥材種植基地，不同年限(3、4、5、6、7 年)各采3 棵。樣品采集后，去除木心，晾干，打粉，過40 目篩備用，并且由安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉守金教授鑒定，均為芍藥科鳳丹Paeonia ostii. T. Hong et J. X. Zhang 的 干燥根皮。

2 方法及結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚對照品0.40、5.95、3.52、9.84 mg，加50%甲醇溶解，定容至10 mL，得質(zhì)量濃度分別為0.040、0.595、0.352、0.984 mg/mL 的對照品溶液，再將其按1 ∶1 ∶1 ∶1 比例混合，即得質(zhì)量濃度分別為 0.010、0.149、0.088、0.246 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品粗粉1 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲(120 W、40 kHz)1 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。再精密量取續(xù)濾液2 mL，置于10 mL 量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm 濾膜，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 采用Zorbax SB-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);甲醇(A)-0.05%磷酸水溶液(B)為流動相，梯度洗脫(0 ～10 min，90%B;10 ～30 min，90% ～70%B;30 ～40 min，70%B;40 ～45 min，70% ～45%B;45 ～55 min，45%B;55 ～60 min，45% ～90%B;60 ～70 min，90% B);體積流量為 1.0 mL/min;檢測波長分別為270 nm (0 ～15 min，沒食子酸)、230 nm (15 ～40 min，氧化芍藥苷和芍藥苷)、274 nm (40 ～70 min，丹皮酚);柱溫為25 ℃;進(jìn)樣量為20 μL。在此色譜條件下，取供試品、對照品溶液適量，分別進(jìn)樣20 μL 測定，發(fā)現(xiàn)這4 種成分均能完全分離，兩者的HPLC 色譜圖見圖1。

圖1 對照品與供試品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液1、2、5、10、20、30 μL，在“2.3”項色譜條件下進(jìn)樣，測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，各成分進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表1。

表1 4 種對照品的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of four reference substances

2.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測定峰面積。結(jié)果，沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的峰面積RSD(n=6)分別為0.2%、0.5%、0.7%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液適量，分別于0、2、4、6、8、12 h 進(jìn)樣20 μL 測定。結(jié)果，沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的峰面積RSD (n = 6) 分 別 為 1.2%、1.8%、1.3%、0.2%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 精密稱取丹皮樣品粗粉6 份，每份1 g，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣20 μL 測定。結(jié)果，沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚含有量的平均值(n =6)分別為0.233%、1.207%、1.067%、2.378%，RSD分別為0.1%、0.9%、1.1%、0.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取沒食子酸對照品7.50 mg，置于100 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻備用;分別精密稱取氧化芍藥苷、芍藥苷對照品15.24、14.82 mg，置于25 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻備用;精密稱取丹皮酚對照品20.40 mg，置于50 mL 量瓶中，加甲醇定容，搖勻備用。然后，取含有量已知的亳州5 年生牡丹皮粉末6 份，每份約0.1 g，分別加入與樣品等量的各對照品溶液，按“2.2”項下方法制備，然后進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表2，表明回收率良好。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 Result of recovery tests

2.9 樣品測定 取不同產(chǎn)地及年限的牡丹皮粗粉適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，重復(fù)3 次，在“2.3”項色譜條件下進(jìn)樣20 μL，測定沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的平均含有量(n=3)，結(jié)果見表3。

表3 牡丹皮樣品中4 種成分含有量測定結(jié)果Tab.3 Result of determination of the contents of four constituents in Moutan Cortex samples

3 討論

本實驗采用HPLC 波長切換法，測定了主產(chǎn)區(qū)與道地產(chǎn)區(qū)牡丹皮中沒食子酸、氧化芍藥苷、芍藥苷、丹皮酚的含有量，并保證各成分在檢測波長處均有穩(wěn)定的基線和紫外吸收。同時，還考察了不同溶劑(50%、70%、90%、100%甲醇)及提取時間，發(fā)現(xiàn)以50%甲醇為溶劑提取1 h 時，效果最理想。

結(jié)果顯示，亳州(主產(chǎn)區(qū))和銅陵(道地產(chǎn)區(qū))的牡丹皮在生長過程中，除沒食子酸含有量呈下降趨勢外，氧化芍藥苷、芍藥苷和丹皮酚等均呈上升趨勢。另外，在樣品采集時發(fā)現(xiàn)，兩地藥材采收年限的差異明顯，銅陵地區(qū)一般在生長5 年時采收，少數(shù)在4 年時采收，而亳州地區(qū)一般在生長6 年后采收，5 年以下者通常不采收，但兩地采收的牡丹皮質(zhì)量基本相當(dāng)。由此可知，在亳州引種推廣牡丹皮藥材是可行的。

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