UHPLC-ESI-MS/MS 法測定大鼠血漿中的山姜素和小豆蔻明

陳偉康， 熊 蔚， 許 妍， 方建和

(1. 江西省藥品檢驗檢測研究院，江西 南昌330029;2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004)

草豆蔻為姜科植物草豆蔻Alpinia katsumadai Hayata 的干燥近成熟種子［1］，藥理研究表明，它具有抗炎、抗腫瘤等作用［2-5］。該植物主要含有揮發(fā)油類及小豆蔻明、山姜素、松屬素和7，4’-二羥基-5-甲氧基雙氫黃酮等［6］黃酮類成分，其中山姜素和小豆蔻明主要存在于姜科植物中，為其抗炎、抗腫瘤的主要活性成分［7-9］，由于兩者為同分異構(gòu)體，故研究它們在體內(nèi)的藥動學(xué)過程具有一定意義。然而，雖然目前國內(nèi)外已有采用HPLC［10-12］及膠束電泳法［13］來測定草豆蔻中這兩種成分的含有量，但其靈敏度僅達(dá)到微克級，不能滿足檢測要求，因此建立一種靈敏度更高的方法，對開展相關(guān)藥動學(xué)研究具有重要意義。本實驗應(yīng)用UHPLCESI-MS/MS 法測定大鼠血漿中山姜素和小豆蔻明的濃度，并進(jìn)行方法學(xué)驗證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該方法簡單、靈敏(定量限為0.2 ng/mL)，可應(yīng)用于血藥濃度監(jiān)測及藥代動力學(xué)研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1290 UHPLC 色譜儀、Agilent真空固相萃取缸(美國Agilent 公司);API 4000三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀(美國ABSCIEX 公司);SORVALL? Biofuge Pico 高速離心機(jī)(美國Sorvall公司);Vortex WX 渦旋混合儀(意大利VELP 公司);Thermo 移液槍 (美國Thermo 公司);NEVAPTM112 氮吹儀(美國Oranomation Associates公司);Waters Oasis? HLB 固相萃取小柱(美國Waters 公司)。

1.2 藥品與試劑 山姜素 (批號110762-200304)、小豆蔻明(批號110763-200403)、土大黃苷(批號110794-201306)對照品(中國食品藥品檢定研究院)。草豆蔻藥材購自江西樟樹藥材市場，經(jīng)鑒定為姜科植物草豆蔻Alpinia katsumadai Hayata 的干燥近成熟種子 (含有量按干燥品計算)，并且其中山姜素、喬松素和小豆蔻明的總含有量為1.40%，榿木酮的含有量為0.61%，符合《中國藥典》2010 年版要求。甲醇、乙腈和甲酸均為色譜純 (美國Sigma-Aldrich 公司);純化水(Milli-Q? 超純水器制備，美國Millipore 公司)。

1.3 實驗動物 雄性SD 大鼠，體質(zhì)量(220 ±20)g (湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，許可證號SCXK ［湘］2009-0004)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex? Luna C18色譜柱(150 mm×2.0 mm，3 μm);流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(20 ∶80)，等度洗脫;體積流量0.4 mL/min;柱溫40 ℃;自動進(jìn)樣器樣品室溫度4 ℃;進(jìn)樣量3 μL;數(shù)據(jù)采集時間6 min。

2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源;正離子檢測模式;噴霧電壓5 000 V;脫溶劑氣溫度500 ℃;脫溶劑氣、噴霧氣及氣簾氣均為零級空氣，壓力分別為60、50、20 psi;碰撞氣為高純氮氣，壓力為6 psi;多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)檢測離子，山姜素和小豆蔻明的定量離子對均為m/z 271.1→167.2，土大黃苷(內(nèi)標(biāo)物)為m/z 421.2→259.1，三者化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1，子離子掃描圖見圖2。然后，對其解簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)、入口電壓(EP)和出口電壓(CXP)進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表1。

圖1 山姜素、小豆蔻明及土大黃苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structures of alpinetin，cardamonin and rhapontin

圖2 山姜素、小豆蔻明和土大黃苷的子離子掃描圖Fig.2 Product ion spectra of alpinetin，cardamonin and rhapontin

表1 質(zhì)譜條件參數(shù)優(yōu)化結(jié)果Tab.1 Optimized result of mass parameters

2.3 對照品溶液的配制 分別精密稱取山姜素和小豆蔻明對照品各10.0 mg，置于100 mL 量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成100 μg/mL對照品貯備液。然后，精密吸取適量，置于量瓶中，加甲醇稀釋，制成10、50、200、500、2 500、5 000、10 000 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)液。再精密稱取土大黃苷對照品10.0 mg，置于100 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成100 μg/mL 內(nèi)標(biāo)貯備液。然后，精密吸取1 mL，置于100 mL 量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，搖勻，制成1 μg/mL內(nèi)標(biāo)溶液，即得，保存于4 ℃冰箱中。

2.4 血漿樣品的處理 精密吸取大鼠血漿100 μL，置于1.5 mL 離心管中，分別加入乙腈100 μL、土大黃苷內(nèi)標(biāo)溶液 (1 μg/mL)100 μL、乙腈700 μL，渦旋混合1 min，再置于高速離心機(jī)內(nèi)離心5 min (13 000 r/min)。然后，精密吸取上清液500 μL，氮吹儀吹干，加5%甲醇溶液500 μL 復(fù)溶，上Waters Oasis? HLB 固相萃取柱(先用甲醇1 mL預(yù)洗，再加水3 mL 沖洗)，5%甲醇溶液1 mL 淋洗，棄去淋洗液，再加50%甲醇1 mL 洗脫，收集洗脫液，氮吹儀吹干，加流動相500 μL 復(fù)溶，溶液經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，取其中3 μL 注入液質(zhì)聯(lián)用儀中進(jìn)行分析。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性試驗 分別取空白血漿、空白血漿加山姜素、小豆蔻明和土大黃苷(內(nèi)標(biāo)物)以及給藥30 min 后的大鼠血漿適量，按“2.4”項下方法制成樣品溶液分析，結(jié)果見圖3。在“2.1”項色譜條件下，山姜素、小豆蔻明、土大黃苷內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為4.3、5.4、3.1 min，表明血漿內(nèi)源性物質(zhì)對待測組分無干擾。

圖3 典型MRM 色譜圖Fig.3 Typical MRM chromatograms

2.5.2 線性關(guān)系、檢出限與定量限 精密吸取空白血漿100 μL，置于1.5 mL 離心管中，分別加入山姜素和小豆蔻明混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL、土大黃苷內(nèi)標(biāo)溶液(1 μg/mL)100 μL 和乙腈700 μL，按“2.4”項下方法制成含山姜素和小豆蔻明1、5、20、50、250、500、1 000 ng/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，分別精密吸取3 μL，注入液質(zhì)聯(lián)用儀中測定，以山姜素和小豆蔻明質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(c)，其與內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)(y)，采用Analyst?1.5.2 工作站，以1/x2權(quán)重擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果，山姜素的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.002 53c+0.005 62，r=0.997 2，而小豆蔻明的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y =0.001 98c+0.006 53，r =0.996 2，兩者線性范圍均在1 ～1 000 ng/mL 之間。另外，這兩種成分在血漿樣品中的最低檢出限質(zhì)量濃度均為0.05 ng/mL，最低定量限質(zhì)量濃度均為0.2 ng/mL(n=6)。

2.5.3 日內(nèi)及日間精密度 精密吸取空白血漿100 μL，加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.4”項下方法制成質(zhì)量濃度分別為5、250、800 ng/mL 的質(zhì)控樣品，進(jìn)樣分析，結(jié)果見表2，表明儀器的精密度良好。

表2 山姜素和小豆蔻明的日內(nèi)和日間精密度試驗Tab.2 Intra-day and inter-day precision tests of alpinetin and cardamonin

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 空白血漿中加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.4”項下方法制成質(zhì)量濃度分別為5、250、800 ng/mL 的質(zhì)控樣品，每個質(zhì)量濃度各3份。第一份質(zhì)控樣品反復(fù)冰凍(-80 ℃)—解凍(20 ℃)3 次，以考察其凍融穩(wěn)定性;第二份質(zhì)控樣品放置在20 ℃環(huán)境下24 h，以考察其短期穩(wěn)定性;第三份質(zhì)控樣品放置在-80 ℃冷凍柜中15 d，以考察其長期凍存穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，3 個質(zhì)量濃度樣品的RSD 均小于8%，表明山姜素和小豆蔻明在上述條件下均無明顯降解。

2.5.5 基質(zhì)效應(yīng) 取空白血漿適量，按“2.4”項下方法制成空白溶液，再分別加入“2.3”項下的山姜素、小豆蔻明及土大黃苷對照品溶液，得到山姜素和小豆蔻明質(zhì)量濃度分別為5、250、800 ng/mL 的樣品溶液，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄基質(zhì)中兩者的峰面積。然后，取其50% 甲醇溶液 (5、250、800 ng/mL)，注入液質(zhì)聯(lián)用儀，記錄峰面積，再將基質(zhì)和50%甲醇中待測物的峰面積相除，用于計算基質(zhì)效應(yīng)(%)。結(jié)果，小豆蔻明和山姜素的平均基質(zhì)效應(yīng)分別為94.6%和93.4%，RSD均小于5%，表明該方法無顯著基質(zhì)效應(yīng)。

2.5.6 方法回收率 取空白血漿18 份，每份100 μL，分成低、中、高3 個濃度組，每組6 份，加入質(zhì)量濃度分別為50、2 500、8 000 ng/mL 的山姜素和小豆蔻明混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL、土大黃苷內(nèi)標(biāo)溶液 (1 μg/mL)100 μL 及乙腈700 μL，按“2.4”項下方法制成質(zhì)量濃度分別為5、250、800 ng/mL 的質(zhì)控樣品，每個樣品6 份，測定其中山姜素和小豆蔻明的濃度，并計算回收率，結(jié)果見表3，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表3 大鼠血漿中山姜素和小豆蔻明的回收率(±s，n=6)Tab.3 Recoveries of alpinetin and cardamonin in rat plasma (±s，n=6)

表3 大鼠血漿中山姜素和小豆蔻明的回收率(±s，n=6)Tab.3 Recoveries of alpinetin and cardamonin in rat plasma (±s，n=6)

成分 加入濃度/(ng·mL -1)測得濃度/(ng·mL -1) 回收率/% RSD/%5 4.41 ±0.27 88.20 ±6.02 6.8 250 246.62 ±12.90 98.65 ±5.23 5.3 800 760.56 ±38.18 95.07 ±5.02 5.3小豆蔻明 5 4.62 ±0.29 92.40 ±6.32 6.8 250 248.15 ±12.71 99.26 ±5.12 5.2山姜素800 744.32 ±34.39 93.04 ±4.62 5.0

2.6 草豆蔻提取物溶液的制備及藥動學(xué)研究

2.6.1 草豆蔻提取物溶液的制備 取草豆蔻0.2 kg，粉碎，過三號篩，加10 倍量70%乙醇，回流提取1 h，過濾，減壓濃縮至濾液無醇味，加1.5%羧甲基纖維素鈉溶液，稀釋至1 000 mL，混勻，即得。然后，參考《中國藥典》2010 年版，測定其中山姜素和小豆蔻明的含有量，結(jié)果每1 mL提取物溶液中含山姜素1.02 mg/mL，含小豆蔻明0.55 mg/mL。

2.6.2 藥動學(xué)研究 取SD 大鼠6 只，給藥前12 h禁食不禁水，灌胃給予草豆蔻提取物(含5 mg/kg 山姜素和2.5 mg/kg 小豆蔻明)。然后，分別于給藥前及給藥后0.083、0.33、0.5、1.5、2、4、6、8 h 眼眶取血約0.4 mL，置于1 mL 肝素鈉離心管中，渦旋2 s，離心10 min (轉(zhuǎn)速2 500 r/min)， -20 ℃下保存?zhèn)溆?。?dāng)測定血藥濃度時，取血漿100 μL，按“2.4”項下方法制成待測溶液，進(jìn)樣分析，DAS 3.0 軟件繪制藥時曲線，以非房室模型來計算藥動學(xué)參數(shù)，結(jié)果見圖4 和表4。

圖4 灌胃給藥后山姜素和小豆蔻明在大鼠體內(nèi)的平均血藥濃度-時間曲線圖(±s，n=6)Fig.4 Mean plasma concentration-time curve of alpinetin and cardamonin in rats after intragastric administration (±s，n=6)

表4 灌胃給藥后山姜素和小豆蔻明在大鼠體內(nèi)的主要藥動學(xué)參數(shù)Tab.4 Main pharmacokinetic parameters of alpinetin and cardamonin in rats after intragastric administration

3 討論

本實驗比較了兩種血漿樣品中乙腈沉淀蛋白和乙腈沉淀蛋白后固相萃取以去除內(nèi)源性干擾物的前處理方法，其中，固相萃取比較時采用Aglea Cleanert? C18和Waters Oasis? HLB 固相萃取柱。結(jié)果顯示，僅用乙腈去除蛋白的效果不理想，故選擇乙腈去除蛋白后再上固相萃取柱。另外還發(fā)現(xiàn)，Waters HLB 固相萃取柱能有效消除基質(zhì)干擾，并且有更好的回收率。

之后，又比較了乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水溶液，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用后者作為流動相時，各待測物的靈敏度顯著提高，背景噪聲得到有效抑制，而且峰形較好。因此，以乙腈-0.1% 甲酸水溶液(20 ∶80)作為測定血漿中待測物的流動相。

同時，還比較了正、負(fù)離子電離模式的質(zhì)譜條件。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用正離子模式檢測待測物及內(nèi)標(biāo)離子時，強(qiáng)度高、重復(fù)性好，表明該模式更為可靠。另外，通過對山姜素、小豆蔻明和土大黃苷進(jìn)行子離子掃描，可知山姜素和小豆蔻明的母離子m/z 均為271.1，而且均產(chǎn)生m/z 為167.2 的子離子碎片，故采用m/z 271.1→167.2 定量離子對進(jìn)行檢測;土大黃苷內(nèi)標(biāo)m/z 421.2→259.1 離子對的響應(yīng)較高，故采用該定量離子對進(jìn)行檢測。

由于山姜素和小豆蔻明為同分異構(gòu)體，均為黃酮類成分，而且結(jié)構(gòu)相似，因此兩者在大鼠體內(nèi)代謝的特性相似。由藥動學(xué)數(shù)據(jù)及藥時曲線可知，灌胃給藥后，兩者均在大鼠體內(nèi)吸收迅速，然后很快在血漿中達(dá)到峰值濃度，代謝速率較快。

本實驗建立了專屬性強(qiáng)、靈敏度高的UHPLCESI-MS/MS 法，用于測定大鼠血漿中山姜素和小豆蔻明的含有量，并對其進(jìn)行了充分驗證。結(jié)果顯示，該方法操作簡單、回收率好、精密度高，適合測定大批量血漿樣品，可應(yīng)用于山姜素和小豆蔻明的藥代動力學(xué)研究。

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