HPLC 法同時(shí)測(cè)定蒿甲醚合成液中的青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚

王令兆， 吳洪達(dá) ， 劉 柳， 劉含智， 劉天時(shí)

(廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州545006)

青蒿素(artemisinin，ART)是我國科研工作者發(fā)現(xiàn)的一種抗瘧藥，具有低毒、高效、見效快等特點(diǎn)，但它在水中的溶解度很低，故作為抗瘧藥，其生物利用度不理想，復(fù)發(fā)性高。因此，科學(xué)家們合成了一系列青蒿素的衍生物［1］，其中蒿甲醚(artemether，ARM)的抗瘧作用是青蒿素的6 倍，具有抗瘧迅速、高效、安全、低毒且與大多數(shù)抗瘧藥無交叉抗性等優(yōu)勢(shì)，是世界衛(wèi)生組織充分肯定和推廣的特效抗瘧藥。

蒿甲醚可由青蒿素或雙氫青蒿素(dihydroartemisinin，DHA)合成，在制備過程中涉及到青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的定量測(cè)定。目前，這3 種成分含有量的測(cè)定方法很多，主要有分光光度法［2-4］、HPLC 法［5-9］等。其中，HPLC 法因其精密度高、穩(wěn)定性好，以及易于分析測(cè)定，因此為最常見的方法，但它又存在待測(cè)物前處理復(fù)雜、檢測(cè)成分單一、色譜峰拖尾、分析時(shí)間長等不足。

本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)了《中國藥典》報(bào)道的方法［10］，建立了一種能同時(shí)測(cè)定蒿甲醚反應(yīng)液中青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚含有量的HPLC 法，解決了雙氫青蒿素色譜峰拖尾的問題，同時(shí)還研究了其α和β 異構(gòu)體在流動(dòng)相中相互轉(zhuǎn)化的問題。結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確，被測(cè)組分能在較大濃度范圍內(nèi)作定量分析。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 LC-20AT HPLC 色譜儀、SPD-20A 紫外檢測(cè)器(日本島津公司);自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 試劑 青蒿素、雙氫青蒿素、β-蒿甲醚對(duì)照品(均為HPLC 級(jí))。乙腈為色譜純(美國Tedia公司);硼氫化鈉等均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);二次蒸餾水(自制)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 ODS-C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為磷酸鹽(20 mmol/L，pH 為5.0)-乙腈水溶液(40 ∶60);柱溫25 ℃;檢測(cè)波長210 nm;體積流量1.0 mL/min;進(jìn)樣量20 μL。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 分別精密稱取青蒿素40.0 mg、雙氫青蒿素20.0 mg 和β-蒿甲醚對(duì)照品20.0 mg，用乙腈溶解，配制成8.0 mg/mL 青蒿素、4.0 mg/mL 雙氫青蒿素和4.0 mg/mL β-蒿甲醚溶液。然后，精密量取以上溶液適量，混勻，稀釋成系列質(zhì)量濃度的混合溶液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.3 反應(yīng)樣品待測(cè)溶液的配制 精密吸取反應(yīng)后的樣品溶液1 mL，加NaHCO3溶液淬火以終止反應(yīng)，再用乙腈定容至5 mL，待樣品中的無機(jī)鹽析出后，取上層清液，0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4 結(jié)果

2.4.1 線性關(guān)系 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，取“2.2”項(xiàng)下溶液適量，平行測(cè)定3 次，記錄峰面積，再以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度(y)分別對(duì)青蒿素峰面積、α-、β-雙氫青蒿素峰面積之和以及β-蒿甲醚峰面積(x)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。由表可知，在一定范圍內(nèi)，被測(cè)組分的質(zhì)量濃度與峰面積均呈良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，取“2.2”項(xiàng)下溶液適量，平行測(cè)定3 次。結(jié)果，青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%、1.3%、1.2%，表明儀器精密度高，達(dá)到HPLC 分析的要求。

2.4.3 回收率 取低、中、高質(zhì)量濃度的反應(yīng)液樣品各一份，測(cè)定其中青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的含有量，再按《中國藥典》中的方法［10］，分別精密加入這3 種成分的對(duì)照品溶液，制備成9 個(gè)供試液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。由表可知，三者的平均回收率分別為98.8%、99.2%、101.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 均小于2.55%，表明該方法回收率良好。

2.4.4 反應(yīng)液樣品的分析 取在20℃下反應(yīng)1.0、1.5 和2.0 h 后的反應(yīng)液，預(yù)處理后分別制成待測(cè)溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分析，色譜圖見圖1，結(jié)果見表3。

在圖1A 中，雙氫青蒿素對(duì)照品出現(xiàn)峰1 (6.4 min)和峰2 (8.1 min)，這是由于β-雙氫青蒿素在流動(dòng)相中逐步轉(zhuǎn)化為α-雙氫青蒿素，表明在流動(dòng)相中放置的時(shí)間越長，其α/β 構(gòu)型的比值越大，在圖中表現(xiàn)為峰1 面積增大，而峰2 面積減小，即前者是α-雙氫青蒿素的響應(yīng)峰，而后者是β-雙氫青蒿素的響應(yīng)峰，與文獻(xiàn)［8-9］報(bào)道一致。另外，在圖1B 中還發(fā)現(xiàn)，β-蒿甲醚色譜峰之前有兩個(gè)新峰，統(tǒng)標(biāo)為峰5 (t=15.4 min 和t=12.9 min)，可能是尚未確定的副產(chǎn)物色譜峰。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard substances and samples

表2 青蒿素、雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的回收率(n=9)Tab.2 Recoveries of ART，DHA and β-ARM (n=9)

表3 樣品的測(cè)定結(jié)果Tab.3 Determination result of samples

3 討論

3.1 磷酸鹽的作用 根據(jù)《中國藥典》中的方法［10］，HPLC 分析青蒿素和雙氫青蒿素的流動(dòng)相為乙腈-水(60 ∶40)。但是，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在該流動(dòng)相下，雙氫青蒿素的色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，無法完全分離α-和β-雙氫青蒿素，見圖2，而如果選擇磷酸鹽緩沖液為流動(dòng)相時(shí)，則峰形明顯好轉(zhuǎn)，分離度提高，見圖1A。推測(cè)拖尾現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是雙氫青蒿素分子中存在羥基，與固定相中的硅羥基有較強(qiáng)的親和力，導(dǎo)致不易脫附，形成拖尾峰，而當(dāng)流動(dòng)相中存在磷酸鹽時(shí)，磷酸氫根離子減弱了雙氫青蒿素與固定相的吸附作用，提高其脫附速率，從而抑制拖尾現(xiàn)象，改善了分離效果。同時(shí)，由于雙氫青蒿素和蒿甲醚在弱酸性環(huán)境下均比較穩(wěn)定［11-12］，故選擇NaH2PO4-Na2HPO4(pH 為5.0)-乙腈水溶液為流動(dòng)相，可避免被測(cè)組分在洗脫分離過程中被分解或轉(zhuǎn)化。

圖2 乙腈-水(60 ∶40)為流動(dòng)相時(shí)的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of CH3CN ∶H2O (60 ∶40)as mobile phase

3.2 流動(dòng)相配比的影響 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)乙腈與緩沖鹽的比例為40 ∶60 時(shí)，青蒿素、α-、β-雙氫青蒿素和β-蒿甲醚的保留時(shí)間均過長，效果不理想。如果增加乙腈比例，則保留時(shí)間縮短，分離度提高，而當(dāng)兩者比例為60 ∶40 時(shí)，被測(cè)組分的色譜峰完全分開，峰型尖銳對(duì)稱，理論塔板數(shù)均在7 000以上，保留時(shí)間較短，見圖1A。然而，當(dāng)兩者比例為80 ∶20 時(shí)，β-雙氫青蒿素和青蒿素的色譜峰出現(xiàn)重疊現(xiàn)象，分離度反而有所降低。

3.3 異構(gòu)體相互轉(zhuǎn)化對(duì)測(cè)定的影響 研究表明，雙氫青蒿素在結(jié)晶狀態(tài)時(shí)，以β 異構(gòu)體存在，而在有機(jī)溶劑中，存在α 與β 異構(gòu)體的相互轉(zhuǎn)化，其反應(yīng)速率受溶劑性質(zhì)的影響，因此在對(duì)這兩種異構(gòu)體進(jìn)行定量分析時(shí)，需考慮溶劑性質(zhì)對(duì)其相對(duì)含有量的影響。文獻(xiàn)［12-14］報(bào)道，在甲醇-水、乙醇-水以及乙腈-水等混合溶劑中，隨著時(shí)間延長，α/β 比值不斷增大，當(dāng)最終達(dá)到平衡時(shí)，其比值與溶劑性質(zhì)有關(guān)。陳有根等［15］報(bào)道，雙氫青蒿素在乙腈中也存在轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，但轉(zhuǎn)化速率較慢，在60 h 后才達(dá)到平衡(α/β=2.11 ∶1)。本實(shí)驗(yàn)研究了雙氫青蒿素異構(gòu)體在乙腈-磷酸鹽水溶液(60 ∶40)中相互轉(zhuǎn)化的速率，結(jié)果見圖3。

圖3 流動(dòng)相中雙氫青蒿素α/β 值隨時(shí)間的變化Fig.3 Change of α/β ratio of DHA in mobile phase with time

由圖3 可知，雙氫青蒿素在最初90 min 內(nèi)的異構(gòu)化速率較大，而在230 min 時(shí)達(dá)到平衡，α/β為3.22，故難以通過HPLC 法分別準(zhǔn)確測(cè)定α-、β-雙氫青蒿素的含有量。但是，吳婧等［16］發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)異構(gòu)體色譜峰面積的比值雖然會(huì)隨時(shí)間而變化，但其峰面積總和不變，即兩者的響應(yīng)值相等。因此，可選兩者的峰面積總和作為雙氫青蒿素的定量基礎(chǔ)。

另外，蒿甲醚也存在α 和β 異構(gòu)體，但研究顯示，β-蒿甲醚在乙腈-磷酸鹽水溶液中較穩(wěn)定?？紤]到該化合物是相關(guān)藥物的有效成分，故本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)β-蒿甲醚進(jìn)行定量分析研究。

［1］ 駱 偉，劉 楊，叢 琳，等. 青蒿素及其衍生物的研究進(jìn)展［J］. 中國藥物化學(xué)雜志，2012，22(2):155-166.

［2］ 李春莉，王莎莉，王亞平，等. 紫外分光光度法測(cè)定青蒿素含量［J］. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，32(4):413-415.

［3］ 劉世堯，白志川. UV-Vis 法測(cè)定重慶武隆縣不同立地條件青蒿樣品的含量［J］. 中國藥房，2008，19(6):438-440.

［4］ 肖文中，詹利之，張美義，等. 三波長分光光度法測(cè)定復(fù)方雙氫青蒿素片中雙氫青蒿素的含量［J］. 藥學(xué)實(shí)踐雜志，2003，21(2):92-94.

［5］ 陳 靖，趙 瑞，陳 俊，等. HPLC-UV-ELSD 聯(lián)用測(cè)定黃花蒿葉片中青蒿素及相關(guān)倍半萜的含量［J］. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，25(11):896-890.

［6］ 丁小莉，吳 強(qiáng)，陳小波，等. UV 法與HPLC 法測(cè)定青蒿中青蒿素含量的比較［J］. 中國藥房，2011，22(3):246-248.

［7］ Souppart C，Gauducheau N，Sandrenan N，et al. Development and validation of a high-performance liquid chromatography-mass spectrometry assay for the determination of artemether and its metabolite dihydroartemisinin in human plasma［J］. J Chromatogr B，2002，774(2):195-203.

［8］ Chimanuka B，Gabriels M，Detaevernier M R，et al. Preparation of β-artemether liposomes，their HPLC-UV evaluation and relevance for clearing recrudescent parasitaemia in Plasmodium chabaudi malaria-infected mice［J］. J Pharm Biomed Anal，2002，28(1):13-22.

［9］ Rajanikantha M，Madhusudananb K P，Guptaa R C，et al.Liquid chromatographic-mass spectrometric method for the determination of α-，β-arteether in rat serum［J］. J Chromatogr B，2003，783(2):391-399.

［10］ 國家藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典:2010 年版二部［S］. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:70，420，1062.

［11］ 吳 越，劉中秋，黃 娟，等. 蒿甲醚與亞鐵鹽合用的穩(wěn)定性考察［J］. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011，31 (6):467-469.

［12］ 王仲山，曹秀玲. 二氫青蒿素的變旋作用與差向異構(gòu)體轉(zhuǎn)化研究［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，1988，23(8):610-615.

［13］ Navaratnam V，Mordi M N，Mansor S M. Simultaneous determination of artesunic acid and dihydroartemisinin in blood plasma by high-performance liquid chromatography for application in clinical pharmacological studies［J］. J Chromatogr B，1997，692(1):157-162.

［14］ 劉 寧，楊臘虎，俞如英. 對(duì)雙氫青蒿素異構(gòu)體的一些研究和分析［J］. 現(xiàn)代科學(xué)儀器，2002(2):52-54.

［15］ 陳有根，余伯陽. 蒿甲醚在模擬體內(nèi)酸堿環(huán)境中的代謝動(dòng)力學(xué)研究［J］. 色譜，2002，20(1):37-39.

［16］ 吳 婧，王銳利，申薇薇，等. 高效液相—柱后衍生化法同時(shí)測(cè)定雙氫青蒿素和哌喹［J］. 中國藥物與臨床，2009，9(3):178-181.