HPLC 法同時(shí)測(cè)定二丁顆粒中的單咖啡酰基酒石酸、秦皮乙素和菊苣酸

占 遠(yuǎn)， 黎田兒， 黃文平， 簡(jiǎn) 輝， 李 艷， 何明珍， 楊世林，* ， 張武崗* ，馮育林， 王永林

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽550004;2. 中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西 南昌330006;3. 江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004)

二丁顆粒是《中國(guó)藥典》2010 年版收載的常用中成藥，具有清熱解毒的功效，用于治療火熱毒盛所致的熱癤癰毒、咽喉腫痛、風(fēng)熱火眼，臨床可用于治療急性咽炎、急性支氣管炎等［1-4］，該藥物主要由紫花地丁、蒲公英、板藍(lán)根和半邊蓮組成。其中，蒲公英的主要成分單咖啡酰基酒石酸和菊苣酸具有增強(qiáng)人體免疫、抗炎、抗氧化作用［5-7］，目前《中國(guó)藥典》2010 年版僅以秦皮乙素這一種成分來衡量二丁顆粒的質(zhì)量，具有一定局限性。因此，基于單咖啡?；剖岷途哲乃岬乃幚砘钚?，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測(cè)定二丁顆粒中單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸這3 種成分的含有量，以期為該藥物的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為其質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)，用于保證臨床安全用藥。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC-20ADXR HPLC 色譜儀，包括可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(PDA)、島津工作站(日本島津公司);Millipore Simplicity 超純水器 (美國(guó)Millipore 公司);AUW220D 電子分析天平(上海天平儀器廠);AB135-S 電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler Toledo 公司)。

1.2 試劑 甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck 公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。

1.3 對(duì)照品 單咖啡?；剖釋?duì)照品(批號(hào)D75-20141017，中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心);秦皮乙素對(duì)照品 (批號(hào) 110741-200506)、菊苣酸對(duì)照品 (批號(hào)111752-200902)(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98%)。

1.4 樣品 二丁顆粒 (批號(hào)分別為140201、140202、140203、140204、140301、140302、140303、140304、140305、140501、140502、140503、140504、140505、140506)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 COSMOSIL C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脫(0.01 ～2 min，2% A;2 ～3 min，2% ～15% A;3 ～25 min，15% ～24%A)。體積流量1 mL/min;柱溫30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)336 nm。在此條件下，單咖啡?；剖帷⑶仄ひ宜?、菊苣酸與其他組分均有較好的分離，理論塔板數(shù)按各峰計(jì)算，均不低于2 000。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取各對(duì)照品適量，置于50 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制得對(duì)照品儲(chǔ)備液。然后，取貯備液適量加以稀釋，制成單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸質(zhì)量濃度分別為0.004 1、0.061 3、0.005 6 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取二丁顆粒粉末0.3 g，置于具塞錐形瓶中，加入70%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min (300 W、40 kHz)，放冷，70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 陰性樣品溶液的制備 按二丁顆粒的處方比例稱取缺紫花地丁、缺蒲公英、缺紫花地丁和蒲公英的其他藥味各一份，根據(jù)其生產(chǎn)工藝，分別制成紫花地丁、蒲公英、紫花地丁和蒲公英空白樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液，即得。

2.5 系統(tǒng)專屬性試驗(yàn) 分別吸取混合對(duì)照品、供試品和陰性樣品溶液20 μL，注入HPLC 色譜儀，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分析。結(jié)果，供試品在與對(duì)照品色譜圖的相同保留時(shí)間處有色譜峰，而陰性樣品則無相應(yīng)峰出現(xiàn)，表明處方中其他成分對(duì)三者的測(cè)定無干擾，見圖1。

2.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液適量，注入HPLC 色譜儀，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，測(cè)定對(duì)照品峰面積。然后，以峰面積為縱坐標(biāo)(y)，進(jìn)樣量(μL)為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行回歸計(jì)算，得到線性方程，發(fā)現(xiàn)均呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見表1。

表1 線性回歸方程Tab.1 Linear regression equations

2.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液4 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次分析，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果，計(jì)算出單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分別為1.2%、0.21%、0.82%，表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別精密吸取同一供試品(批號(hào)140503)溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別于0、1、2、5、8、12 h 進(jìn)樣20 μL 分析，測(cè)定色譜峰面積。結(jié)果，計(jì)算出單咖啡?；剖?、秦皮乙素和菊苣酸的RSD 分別為1.7%、1.7% 和1.8%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1 專屬性HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC specific chromatograms

2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)140503)適量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL 分析。結(jié)果，計(jì)算出單咖啡?；剖帷⑶仄ひ宜睾途哲乃岬腞SD 分別為1.0%、0.79%和1.3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的樣品(批號(hào)140503)0.3 g，共6 份，按其含各成分80%、100%、120%的量，分別加入單咖啡?；剖?2.6 μg/mL)5.5、6.6、8.3 mL，秦皮乙素(319 μg/mL)0.669、0.784、0.992 mL，菊苣酸(2.1 μg/mL)對(duì)照品溶液3.9、4.5、5.8 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣20 μL 分析，結(jié)果見表2，表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.2 Result of recovery tests (n=6)

2.11 檢測(cè)限與定量限 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別精密量取單咖啡?；剖岷途哲乃釋?duì)照品適量，逐級(jí)稀釋進(jìn)樣。最終，確定兩者的檢測(cè)限分別為1.4 和2.2 ng (S/N =3)，定量限分別為8.12 和12.2 ng (S/N ＞10)。

2.12 樣品測(cè)定 取15 批二丁顆粒，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。然后，以回歸方程計(jì)算單咖啡?；剖帷⑶仄ひ宜睾途哲乃岬暮辛?，結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=4)Tab.3 Result of determination of samples (n=4)

3 討論與小結(jié)

3.1 提取條件的選擇 本實(shí)驗(yàn)采用單因素變量法，分別對(duì)提取方法(冷浸、超聲、回流)、提取溶劑(甲醇、乙醇、水)、溶劑比例 (30%、50%、70%甲醇)、提取時(shí)間(30、60、120 min)等因素進(jìn)行考察。結(jié)果顯示，回流和超聲的提取效果優(yōu)于冷浸，但超聲操作更為簡(jiǎn)便，故選擇超聲提取方式;甲醇和水的提取效果明顯優(yōu)于乙醇，而且當(dāng)甲醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)最佳;超聲30 min 后，隨著超聲時(shí)間進(jìn)一步增加，各成分溶出的程度不再明顯增加，故選擇提取30 min。最終，確定提取方法為70%甲醇超聲提取30 min。

3.2 流動(dòng)相及檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 根據(jù)文獻(xiàn)［8-12］，本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液這兩種流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)后者的分離效果更好，故選擇乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動(dòng)相。另外，經(jīng)HPLC 全波長(zhǎng)掃描發(fā)現(xiàn)，單咖啡?；剖帷⑶仄ひ宜睾途哲乃岬淖畲笪詹ㄩL(zhǎng)分別為328、345 和331 nm，由于三者在336 nm 波長(zhǎng)下均有較強(qiáng)的吸收，可同時(shí)被檢測(cè)出，故選擇336 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

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