NMR 法同時(shí)測定注射用丹參多酚酸中的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇

許 磊， 溫時(shí)媛， 王躍飛， 王 萌， 潘桂湘， 姜苗苗*

(1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津市現(xiàn)代中藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300193;2. 天津國際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院，中藥新藥研發(fā)中心，天津300457)

丹參系唇形科植物丹參Salvia miltiorrhiza Bunge 的干燥根及根莖，為傳統(tǒng)常用中藥，具有袪瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩等功效［1］。注射用丹參多酚酸是基于傳統(tǒng)中藥丹參發(fā)展而來的一種凍干粉針劑，主要有效成分為丹參多酚酸，具有活血通經(jīng)功效，制備方法是丹參多酚酸中加入甘露醇等輔料和注射用水，經(jīng)活性炭除熱源，微孔濾膜過濾，再經(jīng)冷凍干燥所得［2］。其中，甘露醇是凍干粉針劑常用的一種賦型劑，主要作用為膨松骨架和助溶，而輔料是注射劑的一個(gè)重要組成部分，也是一種直接進(jìn)入人體血液循環(huán)的物質(zhì)，與用藥安全息息相關(guān)，因此對其進(jìn)行定量測定是非常必要的。

目前，圍繞注射用丹參多酚酸質(zhì)量控制的研究較多［2-6］，測定其主要有效成分酚酸的方法以C18色譜柱為主，但由于甘露醇是極性化合物，不能采用常規(guī)的C18柱進(jìn)行檢測，所以尚未有相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過核磁共振(NMR)技術(shù)，建立了同時(shí)測定注射用丹參多酚酸中主要有效物質(zhì)丹酚酸B等成分和賦形劑甘露醇的方法。繼歐洲和美國藥典收錄NMR 定量檢測方法［7-8］后，《中國藥典》2010年版也將其收載于附錄中［9］。研究表明［10-13］，NMR 法具有樣品前處理簡單、譜圖直觀、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)，能準(zhǔn)確檢測出制劑中的有效成分和輔料，為中藥注射劑中成分的定量測定提供了一種新的手段。

1 儀器與試劑

BRUKER AVANCEⅢ600 超導(dǎo)核磁共振波譜儀，質(zhì)子激發(fā)頻率600.23 MHz，配置BBFO 正相觀察寬帶探頭和5 mm 標(biāo)準(zhǔn)核磁樣品管 (美國NORELL 公司);METTLER TOLEDO XP6 電子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)。

D2O (氘代度＞99.8%)、3-(三甲基硅烷)丙酸-d4鈉鹽 (TSP，內(nèi)標(biāo)，氘代度 ＞98%)、K2HPO4、NaH2PO4(美國Sigma-Aldrich 公司)。迷迭香酸(批號w10-5-3)、紫草酸(批號w14-8-0)、丹酚酸B (批號w15-5-7)對照品(天津中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，純度均大于98%);甘露醇對照品(批號1120B032，北京索萊寶科技有限公司，純度大于96%)。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 內(nèi)標(biāo)溶液制備 稱取K2HPO4、NaH2PO4與內(nèi)標(biāo)物TSP 適量，置于量瓶中，用D2O 溶解，定容至刻度線，制成含1.5 mol/L K2HPO4、1.5 mol/L NaH2PO4、0.2 mg/mL TSP 的內(nèi)標(biāo)溶液，即得，用于所有實(shí)驗(yàn)溶劑。

2.1.2 對照品溶液制備 分別精密稱取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 和甘露醇對照品適量，加入“2.1.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液，制成質(zhì)量濃度分別為1.685、1.235、16.21、12.54 mg/mL 的混合溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱取注射用丹參多酚酸凍干粉20 mg，加入“2.1.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，轉(zhuǎn)移至5 mm 核磁管中，搖勻，即得，直接用于1H-NMR 測試。

2.21H-NMR 測定條件 所有一維1H-NMR 譜均在25 ℃下采集，脈沖序列zgcppr 抑制水峰;譜寬12 335.5 Hz;弛豫延遲時(shí)間20 s;采樣點(diǎn)數(shù)32 k;掃描次數(shù)16 次。然后，為了對其信號進(jìn)行歸屬，根據(jù)文獻(xiàn)［14］，測定指定樣品的2D NMR 譜，包括1H-1H-COSY、1H-1H-TOCSY、1H-13C-HSQC 和1H-13C-HMBC。

2.3 計(jì)算公式 在“2.2”項(xiàng)條件下采集圖譜，對4 種物質(zhì)以及內(nèi)標(biāo)物的定量峰分別進(jìn)行積分，再按照1H-NMR 內(nèi)標(biāo)法，根據(jù)積分結(jié)果來計(jì)算樣品的質(zhì)量［9］，計(jì)算公式如下。

注:ATSP和AS分別是TSP 甲基峰和化合物定量峰的積分面積;nTSP和nS分別代表TSP 甲基峰和化合物定量峰的質(zhì)子個(gè)數(shù);WTSP和WS分別是TSP 和化合物的質(zhì)量;MTSP和MS分別是TSP 和化合物的分子質(zhì)量。

2.4 樣品1H-NMR 圖譜分析 注射用丹參多酚酸的一維1H-NMR 圖譜見圖1。根據(jù)圖譜與文獻(xiàn)［15-17］鑒定丹酚酸B、紫草酸、甘露醇、迷迭香酸，并對其信號進(jìn)行歸屬，見表1。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，置于量瓶中，用“2.1.1”項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)溶液稀釋并定容，制備系列質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。然后，分別取適量溶液裝入NMR 管中，在“2.2”項(xiàng)條件下采集圖譜，以對照品質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(X)，定量峰與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸，得到迷迭香酸回歸方程為Y =0.348 4X +0.026 2，r2=0.999 3;紫草酸為Y=0.216 7X+0.009 5，r2=0.999 4;丹酚酸B 為Y =0.1647 X +0.047，r2=0.999 7;甘露醇為Y=1.867 7X-0.148 9，r2=0.999 5。由此可知，迷迭香酸在1.685 ～0.105 3、紫草酸在1.235 ～0.077 19、丹酚酸B 在16.21 ～1.013、甘露醇在12.54 ～0.783 8 mg/mL 范圍內(nèi)，與定量質(zhì)子峰面積的線性關(guān)系均良好。

圖1 注射用丹參多酚酸的一維1H-NMR 譜(600 MHz)Fig.1 One-dimensional 1H-NMR spectrum of Salvianolate Lyophilized Injection (600 MHz)

表1 注射用丹參多酚酸中丹酚酸B、紫草酸、甘露醇、迷迭香酸的NMR 信號歸屬Tab.1 NMR assignments of salvianolic acid B，lithospermic acid，mannitol and rosmarinic acid in Salvianolate Lyophilized Injection

2.6 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液適量，在“2.2”項(xiàng)條件下連續(xù)測定6 次，記錄積分面積。結(jié)果，計(jì)算出RSD (n =6)分別為丹酚酸B 0.24%、紫草酸1.6%、甘露醇0.26%、迷迭香酸0.48%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品適量，共6 份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行測定。結(jié)果，丹酚酸B 的RSD 為0.55%、紫草酸為1.7%、甘露醇為0.19%、迷迭香酸為2.6%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液適量，分別在0、2、4、8、12、18、24 h 進(jìn)樣測定，記錄積分面積。結(jié)果，計(jì)算出RSD (n =6)分別為丹酚酸B 2.2%、紫草酸1.0%、甘露醇0.45%、迷迭香酸0.84%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取樣品10 mg，共6份，分別精密加入丹酚酸B、紫草酸、甘露醇、迷迭香酸適量，配制供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下采集圖譜，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2，表明該方法回收率良好。

表2 回收率測定結(jié)果(n=6)Tab.2 Result of recovery rates (n=6)

2.10 樣品測定 按照上述方法，對3 個(gè)批號的樣品進(jìn)行定量分析。精密稱取樣品適量，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)條件下進(jìn)行測定，記錄樣品NMR 圖譜，計(jì)算各成分含有量，結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果(n=3)Tab.3 Result of determination of samples (n=3)

3 討論

3.1 溶劑選擇 由于供試品均為水溶性成分，故選擇重水為溶劑。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溶液pH 對NMR圖譜有影響，故另配一定濃度的磷酸鹽緩沖液來穩(wěn)定pH。另外，當(dāng)把樣品溶于內(nèi)標(biāo)溶液中，不進(jìn)行任何處理而直接用于NMR 測試時(shí)，操作簡便，而且能最大程度反映注射劑的真實(shí)組成。

3.2 定量峰選擇 NMR 定量分析是通過比較特定的吸收峰強(qiáng)度來實(shí)現(xiàn)的，所以應(yīng)選擇與其他峰互不重疊的分離較好的峰作為定量峰。通過NMR 一維和二維譜對目標(biāo)化合物的信號進(jìn)行全歸屬，發(fā)現(xiàn)迷迭香酸H-8 (6.16，d，J =16.2 Hz)、紫草酸H-8＇(4.21，d，J =5.4 Hz)、丹酚酸B H-8＇ (4.08，d，J=5.4 Hz)的信號峰與其他峰分離良好，因此被選為定量峰，而甘露醇則選擇3.88 ～3.9 (2H)作為定量峰，見圖2。糖類的端基質(zhì)子信號一般在δ 4.3 ～5.9 之間，而在注射用丹參多酚酸的1H-NMR譜中沒有出現(xiàn)，同時(shí)信號歸屬結(jié)果顯示，甘露醇各部分的積分面積與其質(zhì)子數(shù)成正比，提示其信號峰未受到其他峰干擾。

圖2 迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、甘露醇的1H-NMR 圖譜Fig.2 1H-NMR spectra of rosmarinic acid，lithospermic acid，salvianolic acid B and mannitol

3.3 甘露醇定量 甘露醇為注射用丹參多酚酸的輔料，目前其測定方法有碘量法［9］、紫外-可見分光光度法［18］、HPLC-RID 法［19］和HPLC-ELSD［20-21］法等。其中，碘量法與紫外-可見分光光度法需要經(jīng)過化學(xué)反應(yīng)，操作繁瑣，難以直接測定甘露醇含有量;HPLC-RID 法示差折光檢測器靈敏度低，易受外界影響;HPLC-ELSD 法雖較穩(wěn)定，但甘露醇對色譜柱的要求較高，普通反相C18柱不能保留，需要柱前衍生化，或者用氨基柱和聚合凝膠柱檢測;HPLC 法難以解決同時(shí)測定多酚酸及甘露醇的問題。而本實(shí)驗(yàn)建立的NMR 法是一種無偏向性的檢測方法，可以實(shí)現(xiàn)注射用丹參多酚酸中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 和甘露醇的同時(shí)檢測。

3.4 小結(jié) 中藥注射劑在制備工藝上經(jīng)常需要使用一些輔料，如助溶劑、抗氧化劑、pH 調(diào)節(jié)劑、等滲調(diào)節(jié)劑、膨松劑等。近年來，中藥注射劑安全問題層出不窮，故輔料的安全性日益受到關(guān)注，本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對注射用丹參多酚酸中的有效成分和輔料進(jìn)行定性和定量分析，對保證制劑的安全和有效具有重要意義。

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