對(duì)羥基苯甲醇對(duì)急性腦缺血損傷大鼠腦內(nèi)炎癥因子的影響

蔣 石， 劉姍姍， 向 彬， 林 青， 李秀芳

(云南中醫(yī)學(xué)院，云南 昆明650500)

缺血性腦卒中是當(dāng)今死亡率和致殘率較高的疾病之一，在其復(fù)雜的病理機(jī)制中，神經(jīng)炎癥(neuroinflammation)被認(rèn)為是最重要的病理生理機(jī)制之一，減輕神經(jīng)炎癥有望成為繼溶栓療法之后又一 重 要 的 治 療 策 略［1］。天 麻 (Gastrodia elata Blume)是我國名貴中藥，主產(chǎn)于云南、四川、貴州、陜西等地，具有平肝、息風(fēng)、通血脈、開竅等功效，臨床用于高血壓等疾病的治療取得較好療效［2］。文獻(xiàn)及課題組前期的研究均表明，天麻具有顯著的抗腦缺血再灌注損傷［3］及抗炎作用［4］，對(duì)羥基苯甲醇 (4-hydroxybenzyl alcohol，4-HBA)為其主要活性成分之一，有證據(jù)表明，對(duì)羥基苯甲醇可通過對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷、興奮性氨基酸毒［5］等途徑減輕腦缺血損傷，對(duì)羥基苯甲醇在體外可抑制脂多糖刺激的BV-2 小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)［6］，但該作用在體內(nèi)是否與對(duì)羥基苯甲醇抗腦缺血損傷有關(guān)尚不十分清楚，因此，本實(shí)驗(yàn)從抑制大鼠急性腦缺血后的炎癥反應(yīng)角度對(duì)天麻成分對(duì)羥基苯甲醇的抗腦缺血損傷作用機(jī)制進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 對(duì)羥基苯甲醇(北京百靈威科技有限公司，批號(hào) G6B21-CM);花生四烯酸(Arachidonic Acid，AA) (美國Sigma 公司，批號(hào)SLBJ3652V);地塞米松(大連美侖生物公司，批號(hào)20131215);吐溫-80 (國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)090711);水合氯醛(天津市百世化工有限公司，批號(hào)20100813);Rat TNF-α、IL-1β ELISA 試劑盒 (聯(lián)科生物技術(shù)有限公司);Rat TXA2、6-keto-PGF1α、CysLTs、LTB4ELISA 試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動(dòng)物分組、動(dòng)物模型制備及給藥 清潔級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量240 ～280 g，由四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供(合格證號(hào)SCXK［川］2013-24;批號(hào)0018160)。大鼠隨機(jī)分為5 組，即假手術(shù)組、模型組(灌胃給予1%吐溫-80)、地塞米松組(20 mg/kg 灌胃)、對(duì)羥基苯甲醇高劑量組(20 mg/kg 灌胃)、對(duì)羥基苯甲醇低劑量組(10 mg/kg灌胃)。給藥體積均為1 mL/100 g 體質(zhì)量，1 次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，參照文獻(xiàn)方法［7-8］，復(fù)制大鼠急性腦缺血模型:大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈并結(jié)扎其頸外動(dòng)脈分支和頸總動(dòng)脈近心端，于右頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端插入導(dǎo)管，經(jīng)導(dǎo)管向右頸總動(dòng)脈以0.1 mL/100 g體質(zhì)量注入0.5 mg/kg 的AA。

1.3 大鼠神經(jīng)功能損傷程度評(píng)估 參考文獻(xiàn)［9-10］的方法，對(duì)腦缺血3 h 大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。無神經(jīng)損傷癥狀，0 分;不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪，1 分;向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，2 分;向?qū)?cè)傾倒，3 分;不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失，4 分;死亡，5 分。

1.4 ELISA 檢測腦勻漿中TNF-α、IL-1β、TXA2、6-keto-PGF1α、CysLTs、LTB4的量 腦缺血3 h 后處死大鼠，取腦，于冰浴中用電動(dòng)勻漿器制備腦組織勻漿，3 000 r/min 離心后10 min 獲得上清，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品和待測腦勻漿上清液加入包被好一抗的96 孔板，按試劑盒說明書步驟操作，測定OD值，根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的OD 值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得腦勻漿上清液中的TNFα、 IL-1β、 TXA2、6-keto-PGF1α、 CysLTs、 LTB4的量。

2 結(jié)果

2.1 天麻成分對(duì)羥基苯甲醇可減輕大鼠急性腦缺血模型神經(jīng)功能損傷 假手術(shù)組大鼠未見神經(jīng)功能障礙，模型組大鼠腦缺血3 h 后，神經(jīng)功能損傷評(píng)分明顯增高，對(duì)羥基苯甲醇(20 mg/kg)可顯著改善急性腦缺血模型大鼠神經(jīng)病學(xué)癥狀(表1)。

表1 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠急性腦缺血模型神經(jīng)功能損傷評(píng)分的影響(±s，n=8)Tab.1 Effect of 4-HBA on neurologic scores of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

表1 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠急性腦缺血模型神經(jīng)功能損傷評(píng)分的影響(±s，n=8)Tab.1 Effect of 4-HBA on neurologic scores of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1)神經(jīng)學(xué)評(píng)分假手術(shù)組 —0.00 ±0.00模型組 — 3.14 ±1.07##對(duì)羥基苯甲醇高劑量組 20 1.67 ±0.52*對(duì)羥基苯甲醇低劑量組 10 1.75 ±1.50地塞米松組 20 1.67 ±1.37*

2.2 天麻成分對(duì)羥基苯甲醇可降低大鼠急性腦缺血模型腦組織TNF-α、IL-1β 的量 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈注入AA 誘導(dǎo)血栓形成造成急性腦缺血后，腦組織中TNF-α 和IL-1β 的量顯著升高，對(duì)羥基苯甲醇(20 mg/kg)可 顯 著 降 低TNF-α 和IL-1β 水 平(表2)。

2.3 天麻成分對(duì)羥基苯甲醇可減輕大鼠急性腦缺血模型腦組織TXA2和6-keto-PGF1α的量 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈注入AA 誘導(dǎo)血栓形成造成急性腦缺血后，腦組織中TXA2和6-keto-PGF1α水平顯著升高，對(duì)羥基苯甲醇(20、10 mg/kg)可明顯降低兩者的量(表3)。

表2 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠急性腦缺血模型腦組織TNF-α、IL-1β 量的影響(±s，n=8)Tab.2 Effect of 4-HBA on levels of TNF-α and IL-1β in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

表2 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠急性腦缺血模型腦組織TNF-α、IL-1β 量的影響(±s，n=8)Tab.2 Effect of 4-HBA on levels of TNF-α and IL-1β in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01;與模型組比較，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) TNF-α/(pg·mL -1) IL-1β/(pg·mL -1)620.28 ±261.66 1149.27 ±934.07模型組 — 1459.80 ±448.24## 5281.10 ±357.00##對(duì)羥基苯甲醇高劑量組 20 518.32 ±223.99＊＊ 2622.94 ±1533.57＊＊對(duì)羥基苯甲醇低劑量組 10 1284.37 ±441.29 4908.30 ±934.46地塞米松組 20 477.20 ±121.65＊＊ 2173.71 ±715.60假手術(shù)組 —＊＊

表3 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠急性腦缺血模型腦組織TXA2 和6-keto-PGF1α量的影響(±s，n=8)Tab.3 Effect of 4-HBA on levels of TXA2 and 6-keto-PGF1α in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

表3 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠急性腦缺血模型腦組織TXA2 和6-keto-PGF1α量的影響(±s，n=8)Tab.3 Effect of 4-HBA on levels of TXA2 and 6-keto-PGF1α in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01;與模型組比較，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) TXA2/(pg·mL -1) 6-keto-PGF1α/(pg·mL -1)43.17 ±23.27 78.81 ±68.03模型組 — 155.01 ±48.36## 189.45 ±45.94##對(duì)羥基苯甲醇高劑量組 20 99.29 ±32.06* 95.21 ±52.90＊＊對(duì)羥基苯甲醇低劑量組 10 95.08 ±60.64* 118.21 ±55.66*地塞米松組 20 144.20 ±51.16 129.23 ±29.95假手術(shù)組 —*

2.4 天麻成分對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠急性腦血栓模型腦組織LTB4和CysLTs 的量無明顯影響 大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈注入AA 誘導(dǎo)血栓形成造成急性腦缺血后，腦組織中LTB4和CysLTs 水平顯著升高，但對(duì)羥基苯甲醇對(duì)兩指標(biāo)的量無明顯影響(表4)。

表4 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠急性腦缺血模型腦組織LTB4和CysLTs 量的影響(±s，n=8)Tab.4 Effect of 4-HBA on levels of LTB4 and CysLTs in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

表4 對(duì)羥基苯甲醇對(duì)大鼠急性腦缺血模型腦組織LTB4和CysLTs 量的影響(±s，n=8)Tab.4 Effect of 4-HBA on levels of LTB4 and CysLTs in brain of acute cerebral ischemic rat model (±s，n=8)

注:與假手術(shù)組比較，## P ＜0.01

組別 劑量/(mg·kg -1) LTB4/(ng·L -1) CysLTs/(ng·L -1)233.86 ±162.80 20.72 ±13.46模型組 — 481.34 ± 104.17## 216.09 ±35.68##對(duì)羥基苯甲醇高劑量組 20 464.30 ± 150.50 182.59 ±61.34對(duì)羥基苯甲醇低劑量組 10 346.75 ± 165.90 181.61 ±86.08地塞米松組假手術(shù)組 —20 465.40 ± 121.13 181.54 ±44.36

3 討論

研究證據(jù)表明，興奮性氨基酸毒［11］、氧化應(yīng)激［12］、炎癥反應(yīng)［13］、鈣超載14］、細(xì)胞凋亡［15］等病理機(jī)制參與了腦缺血損傷過程，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡屬于腦缺血損傷的早期事件［16］。腦缺血后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是缺血性腦血管疾病病理過程的重要組成部分，也是加重腦缺血損害的潛在因素［17］。正常情況下，神經(jīng)炎癥是一個(gè)有益的過程，一旦威脅消除或內(nèi)環(huán)境恢復(fù)穩(wěn)態(tài)后便會(huì)自行停止，然而在腦缺血等病理狀況下，腦組織可出現(xiàn)急性和遲發(fā)性炎癥反應(yīng)，持續(xù)的神經(jīng)炎癥過程會(huì)觸發(fā)一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起腦內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥分子水平升高，增加了神經(jīng)元的易損性，破壞血腦屏障，造成腦缺血后的繼發(fā)性損傷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損傷或死亡。腦缺血后，細(xì)胞膜磷脂在磷脂酶A2 的作用下，釋放大量游離的AA，AA 在其限速酶——COX 和5-LO 催化下生成炎癥因子前列腺素(prostaglandins，PGs)及白三烯類(leukotriene，LTs)，COX-2 及COX 途徑下游的炎癥因子PGs 在腦缺血損傷病理過程中發(fā)揮了極為重要的作用［18］，而AA代謝的5-LO 途徑也參與了腦缺血后的炎癥損傷過程［19］。5-LO 途徑的代謝產(chǎn)物CysLTs 與其受體結(jié)合后，可調(diào)節(jié)多種炎癥過程，如血管平滑肌痙攣、毛細(xì)血管通透性增加、過敏反應(yīng)等，LTBs 是目前已知趨化作用最強(qiáng)的趨化因子，可激活白細(xì)胞和其他炎癥細(xì)胞向炎癥部位移動(dòng)。

課題組前期的研究提示，天麻成分對(duì)羥基苯甲醇具有較強(qiáng)的抗急性腦缺血損傷作用，可降低血腦屏障的通透性(另文報(bào)道)，同時(shí)，在一項(xiàng)采用大鼠皮下注射AA 或角叉菜膠引起踝關(guān)節(jié)水腫模型，對(duì)天麻成分對(duì)羥基苯甲醇的抗炎作用進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲醇具有很強(qiáng)的抗炎作用，且其作用機(jī)制主要為抑制AA 代謝的COX 途徑而達(dá)到，結(jié)合兩項(xiàng)研究的結(jié)果及文獻(xiàn)關(guān)于對(duì)羥基苯甲醇可對(duì)抗脂多糖(LPS)刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的報(bào)道，推測對(duì)羥基苯甲醇是否可通過減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)而對(duì)抗腦缺血損傷?為證實(shí)此推測，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈注射血栓誘導(dǎo)劑AA，誘發(fā)同側(cè)大腦半球腦血栓形成的方法，制備大鼠急性腦缺血模型，以大鼠出現(xiàn)腦缺血損傷的神經(jīng)病學(xué)癥狀評(píng)分及ELISA 法檢測大鼠腦組織勻漿液中炎癥因子釋放水平，對(duì)對(duì)羥基苯甲醇的作用機(jī)制進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，對(duì)羥基苯甲醇可明顯改善大鼠神經(jīng)病學(xué)癥狀，顯著降低TNF-α、IL-1β 的水平，具有較強(qiáng)的抗炎作用。為進(jìn)一步探討在腦缺血損傷模型中對(duì)羥基苯甲醇是通過抑制COX 途徑還是5-LO 途徑達(dá)到抗炎作用。于是對(duì)腦組織勻漿中兩條代謝途徑的下游炎癥因子進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，對(duì)羥基苯甲醇對(duì)5-LO 途徑的白三烯類炎癥因子LTB4和CysLTs釋放作用不明顯，而對(duì)COX 途徑的TXA2、6-keto-PGF1α均有明顯的抑制作用，提示天麻成分對(duì)羥基苯甲醇主要是通過抑制AA 代謝的COX 途徑，而達(dá)到減輕腦缺血損傷后的炎癥反應(yīng)，其深入的作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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