水溶性高分子基H2S供體的合成及其光釋放H2S的研究

王 林，李鐘玉，蘭云軍

（浙江省碳材料溫州大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院皮革技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027）

水溶性高分子基H2S供體的合成及其光釋放H2S的研究

王 林，李鐘玉，蘭云軍

（浙江省碳材料溫州大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院皮革技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325027）

硫化氫（H2S）是繼NO和CO后新發(fā)現(xiàn)的一種信號(hào)分子，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。近些年來(lái)，H2S在生物學(xué)和藥理學(xué)領(lǐng)域的研究取得了一些重大進(jìn)展，但仍然有大量的基本問(wèn)題有待解決。本研究結(jié)合高分子藥物傳輸理念和光釋放藥物的方法合理地設(shè)計(jì)了一種包含偕取二硫醇型基本結(jié)構(gòu)單元的高分子H2S釋放源。

硫化氫；信號(hào)分子；光釋放

硫化氫(H2S)氣體最先在1777年被瑞典無(wú)機(jī)化學(xué)家卡爾·威廉·舍勒(Carl Wilhelm Scheele)發(fā)現(xiàn)，它現(xiàn)在已經(jīng)被人們所熟知是一種擁有臭雞蛋氣味的有毒氣體。但是，最近的研究表明它與一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）一樣被認(rèn)為是氣體遞質(zhì)家族的一員[1-3]。研究表明哺乳動(dòng)物體內(nèi)合成硫化氫至少有3種必需的酶:胱硫醚β-合酶（CBS）、胱硫醚γ-裂解酶(CES)和巰基丙酮酸轉(zhuǎn)移酶（MPST)（圖1）。CBS主要存在于大腦、神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟中，而CSE則主要存在于主動(dòng)脈、門靜脈和其他血管組織中[4]。CES主要負(fù)責(zé)脈管系統(tǒng)中的硫化氫產(chǎn)生以及心臟通過(guò)L-硫脲醚和胱氨酸合成L-半胱氨酸、丙酮酸酯和氨的反應(yīng)，MPST主要局限于線粒體中。Kimura和他的同事們證明在α-酮戊二酸存在下MPST和半胱氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶共同作用半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫[5]。也有報(bào)道稱MPST可以在D-氨基酸氧化酶存在條件下將D-半胱氨酸轉(zhuǎn)化成硫化氫。雖然這些酶的表達(dá)都有其組織特異性，但是它們都是將半胱氨酸或者半胱氨酸衍生物轉(zhuǎn)化為硫化氫[6]。這些酶共同精確地調(diào)節(jié)組織內(nèi)的硫化氫含量，因此它們對(duì)硫化氫的體內(nèi)平衡非常重要。

在2014年Foster和他的同事通過(guò)共聚FBEMA和MEO2MA合成水溶性無(wú)規(guī)共聚物Poly（FBEMA-co-MEO2MA），然后通過(guò)FBEMA上的醛基與SATHA上的硫胺基點(diǎn)反應(yīng)，合成具有半胱氨酸敏感的H2S供體。Foster課題組首次合成了可控型高分子硫化氫供體，這種聚合物釋放硫化氫與小分子SATOs一樣都要受到半胱氨酸和谷胱甘肽的調(diào)節(jié)[7]。同年Hasegawa和他的同事利用PEG與ADT-OH偶聯(lián)，合成一種高分子H2S供體PEGADT[8]。他們利用老鼠的巨噬細(xì)胞的內(nèi)吞作用，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并研究了PEG-ADT加強(qiáng)脂多糖感應(yīng)的抗炎作用。

圖1 水溶性硫化氫供體的合成方程式

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑

2,2’-偶氮二異丁腈 (AIBN)、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(Mn=500)、五氧化二磷、磷酸氫二鈉、磷酸一氫鈉全部為分析純。

1.2 水溶性H2S供體的合成及其共釋放H2S的檢量

1.2.1 水溶性無(wú)規(guī)共聚物P(AEMA10-co-OEGMA60)的合成

2-（4-氧代戊酸乙酯）甲基丙烯酸酯（AEMA）(0.40g，1.75×10-3mol)、聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯（Mn=500）(8.76g，1.75×10-2mol)、二硫代苯甲酸-2-(乙氧甲?；?-2-丙酯（ECPDB）(47mg，1.75×10-4mol)和2,2’-偶氮二異丁腈AIBN(5.8 mg，3.5×10-5mol)溶解在4mL DMF的安瓿瓶中。將安瓿瓶放入液氮中凍實(shí)后用油泵抽氣10min，然后放入水中解凍，連續(xù)3次，去除反應(yīng)體系中的氧氣。將安瓿瓶放入70℃的油浴中反應(yīng)3h，再放入水中冷卻，與空氣接觸，終止反應(yīng)。將反應(yīng)混合物溶解在100mL的高純水中，在超濾瓶中經(jīng)100kDa的超濾膜超濾1次，將濾液再放入超濾瓶中經(jīng)4000Da的超濾膜超濾48h。將超濾瓶中的殘留液冷凍干燥得到淺紅色黏稠液體。經(jīng)GPC檢測(cè)數(shù)均分子量Mn=34200，PDI=1.31。1H NMR (500MHz，CDCl3)，δ:4.28×10-6，4.09× 10-6，3.85×10-6～3.45×10-6，3.38×10-6，2.80×10-6，2.63×10-6，2.22×10-6，1.10×10-6～0.75×10-6。

1.2.2 水溶性無(wú)規(guī)共聚物P（TK10-co-OEGMA60）的合成

將聚合物 P（AEMA10-co-OEGMA60） （1.026g，3×10-5mol，Mn=34200，PDI=1.31）和2-硝基芐硫醇 （0.112g，6.6×10-4mol） 混合后加入P2O5(0.09g，6×10-4mol)，反應(yīng)48h。將反應(yīng)混合物溶解在100mL水中用超濾瓶經(jīng)過(guò)100kDa的超濾膜超濾1次，得到的濾液冷凍干燥得到淺黃色黏稠物。經(jīng)GPC檢測(cè)數(shù)均分子量Mn=38700，PDI=1.28。1H NMR (500 MHz，CDCl3)，δ:7.59×10-6，7.50×10-6，7.38× 10-6，4.25×10-6～3.90×10-6，3.75×10-6～3.40× 10-6，3.31×10-6，0.48×10-6，2.03×10-6，1.46×10-6，1.10×10-6～0.75×10-6。

1.2.3 亞甲基藍(lán)H2S水溶液的最大紫外吸收波長(zhǎng)

首先配置80μM的Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液和2mg·mL-1的聚合物pH=7.4的磷酸緩沖溶液，量取45mL的聚合物緩沖溶液于40mm×40mm的石英比色皿中，在光強(qiáng)為200 mW·cm-2條件下照射反應(yīng)。每隔1min取2mL的反應(yīng)液于甲基藍(lán)混合液（30mM FeCl3在1.2M HCl水溶液400 μL，20mM N,N-二甲基-1,4-苯二胺硫酸鹽在7.2M的HCl水溶液400 μL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的醋酸鋅水溶液200 μL，以下同）。對(duì)照樣品為量取2mL的80 μM的Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液于甲基藍(lán)混合液。靜止20min，在550～750nm之間進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。得到最大吸收峰為695nm。

1.2.4 亞甲基藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

首先配置20mM，pH=7.4的磷酸緩沖溶液1L。然后稱取120.20mg Na2S· 9H2O 溶解在100mL的容量瓶中，用pH=7.4磷酸緩沖溶液定容，配置出5mM的Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取5mM的Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200、400、600、800、1000 μL于50mL的容量瓶中，并分別用pH=7.4磷酸緩沖溶液定容。最終分別得到濃度梯度為5、10、20、40、60、80、100 μM的Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液。將梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液分別量取2mL加入甲基藍(lán)混合液，空白樣品為量取2mL的pH=7.4的磷酸緩沖溶液于甲基藍(lán)混合液。靜止20min，分別在695nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，繪制吸光度與Na2S濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5 H2S釋放的動(dòng)力學(xué)研究

量取45mL 2mg·mL-1的聚合物pH=7.4的磷酸緩沖溶液于40mm×40mm的石英比色皿中，在波長(zhǎng)為365nm光強(qiáng)為200mW·cm-2照射反應(yīng)。每隔1min取2mL的反應(yīng)液于甲基藍(lán)混合液。對(duì)照樣品為量取2mL的pH=7.4的磷酸緩沖溶液于甲基藍(lán)混合液。

2 結(jié)果與討論

2.1 核磁共振氫譜（1H NMR)表征

圖2 聚合物Poly(AEMA10-co-OEGMA60)和Poly(TK10-co-OEGMA60)核磁氫譜（1H NMR)

如圖2所示，水溶性無(wú)規(guī)共聚物P(AEMA10-co-OEGMA60)和P(TK10-co-OEGMA60)核磁圖譜對(duì)比，g氫從2.20移動(dòng)到1.45，e氫和f氫分別從2.80和2.63移動(dòng)到2.49和2.04，可以看出羰基在變化為縮硫酮鍵時(shí)拉電子能力減弱，使羰基周圍的e、f、g氫核外電子變多，從而令其向高場(chǎng)移動(dòng)。除此之外，分別在4.08、7.38、7.51、7.89處出現(xiàn)了o、l、m、n氫。因此，從核磁氫譜可以看出，羰基已經(jīng)完全與鄰硝基芐硫醇偶聯(lián)。通過(guò)k氫與g氫的積分面積得出TK∶OEGMA=1∶6。

2.2 傅立葉變換紅外光譜（FT-IR）表征

如圖3所示，虛線代表水溶性無(wú)規(guī)共聚物Poly(AEMA10-co-OEGMA60)的紅外吸收譜圖，實(shí)線代表水溶性無(wú)規(guī)共聚物Poly(AEMA10-co-OEGMA60)與2-硝基芐硫醇偶聯(lián)后的紅外吸收譜圖。從圖3中可以看出酮羰基的吸收出在1728cm-1，偶聯(lián)前后明顯減弱。偶聯(lián)后在1528cm-1出現(xiàn)1個(gè)新的吸收峰為芳香硝基的N-O伸縮振動(dòng)。紅外圖譜表明羰基已經(jīng)偶聯(lián)。

圖3 水溶性無(wú)規(guī)聚合物與鄰硝基芐硫醇偶聯(lián)前后的紅外吸收

2.3 凝膠滲透色譜（GPC）表征

圖4 水溶性無(wú)規(guī)聚合物偶在與鄰硝基芐硫醇聯(lián)前后的凝膠色譜（GPC)

如圖4所示，實(shí)線代表水溶性無(wú)規(guī)共聚物Poly(AEMA10-co-OEGMA60)的GPC圖譜，虛線代表水溶性無(wú)規(guī)共聚物Poly(AEMA10-co-OEGMA60)與2-硝基芐硫醇偶聯(lián)后的GPC圖譜，從圖4中可以看出偶聯(lián)后，GPC峰值偏移并不是很明顯，但是還是向左偏移，而且分布變窄。這從側(cè)面進(jìn)一步證明羰基與鄰硝基芐硫醇偶聯(lián)。

如圖5所示，水溶性H2S供體聚合物的磷酸緩沖溶液在經(jīng)過(guò)UV (365nm)光照后與亞甲基藍(lán)混合液混合的紫外吸收與Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液與亞甲基藍(lán)混合溶液混合的紫外吸收相同，最大吸收峰都在695nm處。并且隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng)紫外吸收的強(qiáng)度變強(qiáng)，因此可以利用Na2S標(biāo)準(zhǔn)溶液作為H2S的標(biāo)準(zhǔn)溶液，做Na2S濃度與吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖5 亞甲基藍(lán)H2S水溶液的紫外吸收

如圖6所示，通過(guò)不同標(biāo)準(zhǔn)濃度的Na2S，及其亞甲基藍(lán)紫外吸收繪制出一條H2S濃度與吸光度相關(guān)的直線y=0.01894x+0.0231, 相關(guān)系數(shù)為0.99779。

圖6 Na2S亞甲基藍(lán)法標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖7所示，2mg·mL-1聚合物Poly(AEMA10-co-OEGMA60)的pH=7.4的磷酸緩沖溶液在紫外光365nm、200 mW·cm-2的光強(qiáng)下在12min時(shí)達(dá)到峰值，最大釋放量達(dá)到50μM。沒(méi)有光照的聚合物不能釋放硫化氫。

圖7 2 mg·mL-1聚合物mPEG-TK的膠束在pH=7.4的磷酸緩沖溶液H2S光釋放與時(shí)間的關(guān)系

3 結(jié)論

通過(guò)RAFT無(wú)規(guī)共聚單體AEMA和OEGMA合成水溶性無(wú)規(guī)聚合物Poly(AEMA10-co-OEGMA60)，然后P2O5無(wú)溶劑催化與鄰硝基芐硫醇反應(yīng)合成了偕取二硫醇型H2S供體聚合物Poly(TK10-co-OEGMA60)，通過(guò)不同的表征方法證明了目標(biāo)產(chǎn)物，通過(guò)亞甲基藍(lán)法考察了聚合物的H2S釋放。

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Synthesis and Investigation of Water-soluble and Photocontrollable Polymeric Hydrogen Sulfide

WANG Lin, LI Zhong-yu, LAN Yun-jun
(Zhejiang Key Laboratory of Biomass Materials, College of Chemistry and Materials Engineering, Wenzhou University, Wenzhou 325027, China)

Hydrogen sulf de (H2S) was a newly recognized signaling molecule with very potent cytoprotective actions. Although the f elds of H2S physiology and pharmacology had rapidly growing in recent years, a number of fundamental issues still need to be addressed to advance our understanding of the biology and clinical potential of H2S in the future. Herein, we rationally designed and synthesized a new ideal H2S donor using the concept of polymeric drug delivery and stimuli-responsiveness.

hydrogen sulf de; signaling molecule; photoresponse

TQ 251.1+2

A

1670-9905(2015)05-0029-04

王林（1988-），男，碩士，研究方向:應(yīng)用高分子化學(xué)，E-mail:dzwl1115@163.com

2015-03-16