耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥機制及同源性分析

張筠 鄧在春 馬紅映 呂丹 汪麗

1．寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸科，浙江寧波315000；2．寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院細菌室，浙江寧波315000

耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥機制及同源性分析

張筠1鄧在春1馬紅映1呂丹1汪麗2

1．寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院呼吸科，浙江寧波315000；2．寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院細菌室，浙江寧波315000

目的探討耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌的耐藥機制，并進行同源性分析。方法選擇2010年1月～2014年12月189株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株進行分析，采用Hodge方法測定碳青霉烯酶表型，采用B－last方法測定超廣譜β內(nèi)酰胺酶、PCR進行耐藥基因測序，REP－PCR方法進行同源性分析。結(jié)果189株菌株對厄他培南、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、美洛培南、頭孢西丁的耐藥率均超過90%。對米諾環(huán)素的耐藥率相對較低，對替加環(huán)素的耐藥率為0。改良Hodge法檢測碳青霉烯酶陽性率79．9%，廣譜β－內(nèi)酰胺酶檢測陽性率54．0%。KPC基因陽性率60．3%，IMP基因陽性率3．7%；Amp－C酶基因陽性率12．7%；162株blaSHV陽性，陽性率85．7%，其中blaSHV-11為優(yōu)勢基因；120株blaTEM陽性，其中blaTEM-1為優(yōu)勢基因；90株blaCTM-M陽性，其中blaCTM-M-14為優(yōu)勢基因。同源性分析結(jié)果顯示G型比例最高，占55．0%，其次為J型，占16．4%。結(jié)論耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥機制復雜，以G型克隆株為主。臨床工作中應根據(jù)藥敏結(jié)果規(guī)范使用抗菌藥物。

碳青霉烯類；耐藥；肺炎克雷伯菌；同源性分析;超廣譜β內(nèi)酰胺酶

碳青霉烯類抗生素具有抗菌作用強、抗菌譜廣的特點，是目前治療多重耐藥革蘭陰性細菌的重要藥物[1]。但是近年來，臨床上對碳青霉烯類耐藥率逐漸升高。耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株的耐藥機制復雜，其中產(chǎn)生碳青霉烯酶就是重要機制之一[2，3]。本研究通過對189株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株進行研究，分析其耐藥機制以及同源性?，F(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

選擇2010年1月～2014年12月在我院分離出的189株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌進行研究。189株菌株中58株分離于痰液，47株分離于血液標本，34株分離于尿液，33株分離于胸腔積液，17株分離于分泌物。MHA培養(yǎng)基、血瓊脂平板、亞胺培南、厄他培南、阿莫西林/克拉維酸、頭孢他啶/克拉維酸、美羅培南、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢噻肟/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢西丁、呋喃妥因、四環(huán)素、復方磺胺甲唑、妥布霉素、阿米卡星、替加環(huán)素，環(huán)丙沙星藥敏紙片，PCR試劑盒，DNA Marker，PCR擴增引物。全自動微生物鑒定儀、恒溫培養(yǎng)箱、PCR擴增儀、凝膠成像系統(tǒng)等。

1.2 研究方法

1．2．1 藥敏試驗采用E－test方法檢測抗菌藥物對菌株的MIC，厄他培南采用紙片擴散檢測抑菌圈。E－test方法：將待測菌株涂在MH平板，均勻涂抹，干燥3～10 min，將E－test條放在平板上，37℃，培養(yǎng)20 h后觀察結(jié)果。紙片擴散：將待測菌株涂在MH平板，均勻涂抹，干燥3～10 min，中央貼厄他培南紙片一張，測量抑菌圈。結(jié)果根據(jù)2012年CLSI M100－S22文件標準進行判斷。

1．2．2 改良Hodge試驗大腸埃希菌ATCC25922采用直接菌落懸液方法制備0．5麥氏濁度菌懸液，用8．5 g/L氯化鈉溶液1∶10稀釋，涂在MH瓊脂平板上，干燥3～10 min，中央貼美洛培南紙片。用拭子挑3～5個待測菌菌落或者質(zhì)控菌懸液，從紙片邊緣到平板邊緣劃直線的方式接種，37℃培養(yǎng)20 h。MHT陽性：接種先與大腸埃希菌抑菌環(huán)交接產(chǎn)生向抑菌圈內(nèi)增強生長現(xiàn)象，說明待測菌產(chǎn)生碳青霉烯酶。

1．2．3 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測待測菌0．5麥氏濁度，均勻涂在MH平板，干燥3～10 min，貼頭孢他啶/克拉維酸、頭孢他啶、頭孢噻肟/克拉維酸。37℃孵育18 h，任一復合紙片抑菌環(huán)直徑與單一紙片抑菌環(huán)直徑相比≥5 mm，則為產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶。

1．2．4 耐藥基因PCR檢測制備耐藥基因檢測模板。采用PCR擴增法檢測碳青霉烯酶基因。獲得的基因陽性菌株P(guān)CR擴增產(chǎn)物提純，進行雙向測序，結(jié)果與已知序列比對。

1．2．5 菌株同源性分析采用REP－PCR方法進行基因擴增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，染色，成像后拍照。根據(jù)電泳條數(shù)、長度進行同源性分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用EXCEL表格統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用SPSS12．0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用n（%）表示，采用χ2檢驗，P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 耐藥分析結(jié)果

189株菌株對厄他培南、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、美洛培南、頭孢西丁的耐藥率均超過90%。對米諾環(huán)素的耐藥率相對較低，對替加環(huán)素的耐藥率為0。見表1。

表1 耐藥分析結(jié)果（n=189）

2.2 碳青霉烯酶檢測結(jié)果及超廣譜β-內(nèi)酰胺酶檢測結(jié)果

改良Hodge法檢測碳青霉烯酶陽性率79．9%（151/189），超廣譜β－內(nèi)酰胺酶檢測陽性率54．0%（102/189）。以PCR結(jié)果為金標準，改良Hodge法檢測碳青霉烯酶存在假陽性和假陰性的情況，但是統(tǒng)計學比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0．05）。見表2。

表2 Hodge與PCR碳青霉烯酶基因檢測結(jié)果比較[n（%）]

2.3 耐藥基因測序及序列分析

KPC基因陽性率60．3%，IMP基因陽性率3．7%，Amp－C酶基因基因陽性率12．7%；162株blaSHV陽性，陽性率85．7%，其中blaSHV-11160株，為優(yōu)勢基因；120株blaTEM陽性，陽性率63．5%，其中blaTEM-196株，為優(yōu)勢基因；90株blaCTM-M陽性，陽性率47．6%，其中blaCTM-M-1468株陽性。1株菌株同時含blaKPC-2和blaIMP-4基因，3株同時有blaCTM-M-14基因和blaCTM-M-65基因，126株同時含有3種及以上耐藥基因。耐藥基因測序及序列分析見表3。

2.4 同源性分析

G型比例最高，占55．0%，其次為J型，占16．4%。見表4。

表3 耐藥基因測序及序列分析（n=189）

表4 REP-PCR同源性分析（n=189）

3 討論

肺炎克雷伯菌是革蘭陰性桿菌，是臨床上常見的病原菌，細菌有莢膜，主要的感染部位是肺部。隨著廣譜抗菌素在臨床上的應用，ESBLs、AmpC酶、AMEs產(chǎn)生，目前多重耐藥情況嚴重[4-6]。ESBLs產(chǎn)生、外膜孔蛋白缺失、形成生物被膜是肺炎克雷伯菌的主要耐藥機制[7，8]。

亞胺培南是最早研發(fā)的碳青霉烯類抗菌藥物，在1987年問世，是第一代碳青霉烯類抗菌藥物，隨后出現(xiàn)帕尼培南。1995年后，研發(fā)出第二代碳青霉烯類抗菌藥物，主要是美洛培南和厄他培南。目前第三代碳青霉烯類抗菌藥物已經(jīng)在臨床上應用，其具有更強的抗銅綠假單胞菌活性，并且有口服劑型。碳青霉烯類抗菌藥物具有廣譜和強大的抗菌活性，能夠迅速殺菌，減少細菌內(nèi)毒素的釋放，對臨床常見的β內(nèi)酰胺酶（例如AmpC）具有高度的穩(wěn)定性，對腸桿菌科細菌具有高度的敏感性，臨床療效肯定，血液透析能夠清除[9，10]。既往，臨床上對碳青霉烯類抗菌藥耐藥的菌株較少見。但隨著抗菌藥物在臨床上的不規(guī)范使用，耐藥菌逐漸出現(xiàn)，為臨床上的治療造成困難。

肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類的耐藥機制十分復雜，與產(chǎn)生碳青霉烯酶、AmpC酶過度表達、外膜孔蛋白丟失、高親和碳青霉烯類的位點數(shù)量下降或缺失，或者親和力下降等有關(guān)[11，12]。而碳青霉烯酶的產(chǎn)生是重要的耐藥機制之一。碳青霉烯酶由耐藥菌株產(chǎn)生，屬于一類β-內(nèi)酰胺酶，能夠水解碳青霉烯類藥，這類酶有絲氨酸酶以及金屬酶[13-15]。既往研究顯示，肺炎克雷伯菌主要產(chǎn)生的碳青霉烯酶主要是A類和B類，而A類為絲氨酸酶，其中KPC型最常見，能夠被克拉維酸所抑制；B類為金屬酶，以IMP、VIM、GIM多見，能夠解除氨曲南之外所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素[16-20]。

本次納入研究的189株耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌株中，耐藥分析結(jié)果顯示，其對厄他培南、頭孢噻肟、頭孢他啶、亞胺培南、阿莫西林/克拉維酸、氨曲南、美洛培南、頭孢西丁的耐藥率均超過90%，而對替加環(huán)素的耐藥率為0，說明其對替環(huán)加素具有較好的敏感性，而對阿米卡星、妥布霉素、米諾環(huán)素等也具有一定的敏感性。耐藥菌株的基因多樣，且可同時表達多個耐藥基因，這給臨床上的治療造成了極大的困難。替加環(huán)素是新型四環(huán)素類藥物，對多重耐藥的G-桿菌具有較好的抗藥活性。根據(jù)本次研究的結(jié)果，在臨床工作中，對于多重耐藥的肺炎克雷伯菌，可首選替加環(huán)素治療。

189株待測菌株采用Hodge試驗檢測，結(jié)果顯示碳青霉烯酶陽性率為79.9%，以PCR方法為標準，該結(jié)果高于PCR檢測結(jié)果，說明存在一定的假陽性。但是對兩種檢測方法的符合情況進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果顯示兩種檢測方法差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

耐藥基因序列分析結(jié)果顯示，KPC基因陽性率60.3%，IMP基因陽性率3.7%，而其中1例同時有KPC基因和IMP基因，因此，120株耐藥菌株因產(chǎn)生碳青霉烯酶而耐藥，占63.5%。另外，189株耐藥菌Amp-C酶基因、超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因攜帶率高。162株blaSHV陽性，陽性率85.7%，其中blaSHV-11160株，為優(yōu)勢基因；120株blaTEM陽性，陽性率63.5%，其中blaTEM-196株，為優(yōu)勢基因；90株blaCTM-M陽性，陽性率47.6%，其中blaCTM-M-1468株陽性。本研究還發(fā)現(xiàn)126株同時含有3種及以上耐藥基因，可能是多重耐藥的基因基礎(chǔ)，說明耐藥肺炎克雷伯菌的耐藥機制十分復雜，臨床治療也會越來越困難。耐藥基因同源性分析結(jié)果顯示，本醫(yī)院分離出的耐藥菌株以G型為主，其次為J型，其他類型相對較少。

綜上所述，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌耐藥機制復雜，在同一醫(yī)院流行的耐藥菌株具有相似的基因型以及耐藥表型，可能與地區(qū)流行以及院內(nèi)感染有關(guān)，因此在臨床工作中，院內(nèi)感染應重點關(guān)注多重耐藥菌株的傳播。另外，在臨床工作中，對抗菌藥物的選用，應根據(jù)藥敏結(jié)果以及感染部位的血藥濃度等選擇最合適的藥物治療，規(guī)范化使用抗生素，減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

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Analysis of resistance mechanisms and homology of carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae

ZHANG Yun1DENG Zaichun1MA Hongying1LV Dan1WAGN Li2
1．Department of Respiration,the Affiliated Hospital of Medical College of Ningbo University,Ningbo315000,China; 2．Bacteriology Room,the Affiliated Hospital of Medical College of Ningbo University,Ningbo315000,China

Objective To analyze resistance mechanisms and homology of carbapenem－resistant Klebsiella pneumoniae．Methods From January 2010 to December 2014,189 carbapenem－resistant Klebsiella pneumoniaes were analyzed, carbapenemases phenotype by Hodge,ESBLs was tested by B－last,resistance gene sequencing was tested by PCR,homologous points was detected by REP－PCR．Results Resistance rates of 189 strains to ertapenem,cefotaxime,ceftazidime,imipenem,amoxicillin/clavulanic acid,aztreonam,meropenem,cefoxitin were more than 90%．Resistance rate to minocycline was low,and to tigecycline was 0．Carbapenemases phenotype positive rate by Hodge was 79．9%，and ESBLs was 54．0%．KPC gene positive rate was 60．3%；IMP was 3．7%;Amp－C was 12．7%;162 strains of blaSHVwas positive,accounting on 85．7%,and blaSHV-11was dominant gene;120 strains of blaTEMwas positive,and blaTEM-1was dominant gene;90 strains of blaCTM-Mwas positive,and blaCTM-M-14was dominant gene．Homology analysis showed that G－type was the highest proportion of 55．0%,followed by J－type,accounting for 16．4%．Conclusion Resistance mechanisms of carbapenem－resistant Klebsiella pneumoniae is complex,and G－type clone is main clone．The use of antibiotics should be based on susceptibility results．

Carbapenems;Resistance;Klebsiella pneumoniae;Homology analysis;ESBLs

R446.5

A

1673-9701（2015）27-0016-04

2015-08-10）

浙江省寧波市醫(yī)學科技計劃項目（2013A19）