金櫻子鞣質(zhì)提取率影響因素分析及提取條件優(yōu)化

晏建新 王曉麗

1.貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴州貴陽(yáng)550001；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550004

金櫻子鞣質(zhì)提取率影響因素分析及提取條件優(yōu)化

晏建新1，2王曉麗2▲

1.貴州省人民醫(yī)院藥劑科，貴州貴陽(yáng)550001；2.貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550004

目的優(yōu)化金櫻子中鞣質(zhì)的超聲提取工藝。方法采用磷鉬鎢酸-紫外分光光度法測(cè)定鞣質(zhì)含量，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取液料比、超聲提取時(shí)間和乙醇百分濃度作為自變量，金櫻子鞣質(zhì)提取率為因變量，對(duì)自變量各水平進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式擬合，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法選擇最佳工藝條件，并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果最佳工藝為：乙醇濃度75%，料液比1∶30，超聲提取時(shí)間60 min，提取溫度為50℃。結(jié)論優(yōu)化的金櫻子中鞣質(zhì)超聲波提取工藝簡(jiǎn)便可靠、穩(wěn)定、提取率高，為金櫻子中鞣質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

金櫻子；鞣質(zhì)；超聲提??；響應(yīng)面法

金櫻子是薔薇科植物金櫻子（Rosa laevigata Michx.）的干燥成熟果實(shí)［1］，又名蜂糖罐，在我國(guó)大多數(shù)地方均有分布，特別是貴州省分布廣，產(chǎn)量高［2］。金櫻子藥食同源［3］，具有補(bǔ)腎固精、止瀉之功效?；瘜W(xué)成分研究多為多糖類(lèi)和黃酮類(lèi)，對(duì)鞣質(zhì)類(lèi)研究較少。鞣質(zhì)具有收斂性，內(nèi)服可治胃腸道出血、水瀉等癥，被認(rèn)為是良好的天然抗氧化劑［4］。鞣質(zhì)是一類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，植物界廣泛存在，近幾年的研究表明鞣質(zhì)具有較好的抗腫瘤活性［5］。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)是在二水平析因設(shè)計(jì)的基礎(chǔ)上，加中心點(diǎn)和星點(diǎn)組成，實(shí)驗(yàn)次數(shù)較少，對(duì)非線性擬合的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較適宜，具有實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、試驗(yàn)次數(shù)少、精密度高的特點(diǎn)［6］。響應(yīng)面法集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)方法于一體，是建模和多元變量最優(yōu)化的一種統(tǒng)計(jì)方法［7］。對(duì)于中藥有效成分的提取工藝研究，星點(diǎn)設(shè)計(jì)以及效應(yīng)面優(yōu)化法是重要的實(shí)驗(yàn)條件設(shè)計(jì)、優(yōu)化方法之一，具有數(shù)據(jù)量大、預(yù)測(cè)性好、直觀的優(yōu)點(diǎn)，比正交和均勻設(shè)計(jì)更適用于探索性的試驗(yàn)研究。因此采用此方法研究金櫻子中鞣質(zhì)的超聲提取工藝，為金櫻子的合理開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試藥

超聲清洗儀（上海超聲設(shè)備有限公司，SK3300H型）；紫外分光光度計(jì)（津島UV-2401型，日本）；分析天平（FA2004，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；HH-2恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；FZ102型粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器公司）。

沒(méi)食子酸（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)為：110831-200302），其他所有試劑均為分析純；水為重蒸水。按《中國(guó)藥典》2010年版制訂的方法配制磷鉬鎢酸試液。

金櫻子，2013年10月采自貴州遵義縣團(tuán)溪鎮(zhèn)，經(jīng)貴陽(yáng)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院王曉麗教授鑒定為薔薇科植物金櫻子的成熟果實(shí)。

2 方法與結(jié)果

2.1 鞣質(zhì)的含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取沒(méi)食子酸對(duì)照品25 mg，置于100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，精密量取10 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻即得0.05 mg/mL沒(méi)食子酸溶液。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取對(duì)照品沒(méi)食子酸溶液0.5、1.0、2.0、4.0、5.0 mL分別置于25 mL棕色量瓶中，分別加磷鉬鎢酸溶液1 mL，再分別加水11.5、11、9、8、7 mL，搖勻，用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度［8］，搖勻，放置30 min，以相應(yīng)的試劑作空白實(shí)驗(yàn)，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在波長(zhǎng)為760 nm處測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其線性方程為Y=0.0609X-0.0056（r=0.9997），表明沒(méi)食子酸在0.001～0.011 mg/mL與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.3 供試品溶液的制備金櫻子去刺、去核毛，置60℃恒溫箱中烘干，自然冷卻后粉碎（過(guò)60目篩），精密稱(chēng)取粉末1 g，置250 mL棕色量瓶中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別精密加入不同百分濃度、不同體積的乙醇，密塞，稱(chēng)定其質(zhì)量；超聲波處理不同時(shí)間（超聲功率100 W，控制水溫在50℃以下［9-10］）后，取出稱(chēng)其質(zhì)量，用相應(yīng)濃度乙醇補(bǔ)足失掉的質(zhì)量，搖勻，靜置后濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 mL，在25℃條件下，減壓回收至不含乙醇為止，轉(zhuǎn)移至25 mL棕色量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置后過(guò)濾，續(xù)濾液即供試品溶液［11］。

2.2 樣品測(cè)定

鞣質(zhì)含量測(cè)定［12］按照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XB進(jìn)行［1］。

2.2.1 總多酚含量的測(cè)定精密量取供試品溶液2 mL，置25 mL棕色容量瓶中，加入磷鉬鎢酸試液1 mL，加水10 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下“然后用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度”起，測(cè)定其吸光度，利用線性方程計(jì)算供試品溶液總多酚含量。

2.2.2 不被吸附的多酚含量的測(cè)定精密稱(chēng)取干酪素0.6 g于100 mL具塞錐形瓶中，精密量取供試品溶液25 mL加入錐形瓶中，密塞，置于30℃的水浴中保溫1 h，期間時(shí)時(shí)搖動(dòng)，取出放冷，搖勻，過(guò)濾取續(xù)濾液2 mL置25 mL棕色量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下下“然后用20%碳酸鈉溶液稀釋至刻度”起測(cè)定吸光度；同時(shí)空白實(shí)驗(yàn)，不被吸附多酚的吸光度=供試品溶液中多酚的吸光度-空白溶液的吸光度，利用線性方程計(jì)算供試品溶液不被吸附的多酚含量。

2.2.3 鞣質(zhì)含量的計(jì)算鞣質(zhì)的含量=總多酚含量-不被吸附多酚含量，鞣質(zhì)是可被干酪素吸附的多酚；鞣質(zhì)提取率（%）=提取出的鞣質(zhì)含量/藥材中鞣質(zhì)的含量×100%。

2.3 單因素試驗(yàn)考察

2.3.1 乙醇百分濃度稱(chēng)取干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱(chēng)定，分別加入40%、50%、60%、70%、80%的乙醇30 mL于100 mL容量瓶中，超聲時(shí)間為60 min后，按“2.2”項(xiàng)下來(lái)計(jì)算鞣質(zhì)提取率分別為5.16%、5.57%、5.98%、5.97%、5.96%，故選取乙醇濃度70%。2.3.2液料比稱(chēng)取干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱(chēng)定，分別加入40%的乙醇10、20、30、40、50 mL于100 mL容量瓶中，超聲時(shí)間為60 min，按“2.2”項(xiàng)下計(jì)算鞣質(zhì)提取率分別為4.29%、5.31%、5.76%、5.56%、5.58%，故選取液料比30∶1。

2.3.3 超聲提取時(shí)間稱(chēng)取下干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱(chēng)定，加入50%的乙醇30倍量于100 mL容量瓶中，分別超聲提取30、40、50、60、70 min，按“2.2”項(xiàng)下計(jì)算鞣質(zhì)提取率分別為4.22%、5.41%、5.58%、5.81%、5.67%，故選取提取時(shí)間60 min。

2.3.4 超聲提取溫度稱(chēng)取下干燥的金櫻子粉末約1.0 g，共5份，精密稱(chēng)定，加入70%的乙醇30倍量于100 mL容量瓶中超聲提取60 min，分別在提取溫度30、40、50、60、70℃，按“2.2”項(xiàng)下計(jì)算鞣質(zhì)提取率分別為4.22%、5.31%、5.45%、4.35%、3.67%，故選取超聲提取溫度為50℃。溫度高于50℃時(shí)，鞣質(zhì)易發(fā)生變質(zhì)［9］，故采用冷凝水控制超聲溫度在50℃左右［10］。

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)選

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，上述4個(gè)自變量對(duì)金櫻子中鞣質(zhì)提取效果的影響程度較大的有乙醇百分濃度、超聲提取時(shí)間、液料比，因提取溫度的溫度范圍較小，所以對(duì)鞣質(zhì)提取率影響亦較小，所以通過(guò)CCD法對(duì)鞣質(zhì)提取率影響較大的超聲提取時(shí)間、乙醇百分濃度及液料比3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)選，以鞣質(zhì)提取率為因變量，設(shè)計(jì)了分別用代碼-α，-1、0、1、α（α=1.732）表示的三變量五水平實(shí)驗(yàn)，變量水平見(jiàn)表1，試驗(yàn)安排和結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 金櫻子中鞣質(zhì)超聲提取工藝優(yōu)選試驗(yàn)變量水平

將表2中數(shù)據(jù)運(yùn)用Design-Expert 7.0.0軟件進(jìn)行響應(yīng)曲面分析，以鞣質(zhì)提取率（Y）為響應(yīng)值分別對(duì)各因素進(jìn)行多元線性回歸和二項(xiàng)式方程擬合，得多元線性回歸為：Y=5.53+0.11A+0.27B+0.27C（r=0.7908），說(shuō)明模型擬合度和預(yù)測(cè)性較差，即多元線性模型不適合；故重新采用二項(xiàng)式擬合，得二項(xiàng)式模型為：Y=5.84+ 0.11A+0.27B+0.27C+0.046AB+0.044AC+0.029BC-0.043A2-0.26B2-0.14C2（r=0.9797），表明二次回歸方程擬合度以及可信度均較好。采用此模型進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)，其方差分析見(jiàn)表3。

表2 金櫻子鞣質(zhì)超聲提取工藝優(yōu)選試驗(yàn)安排和結(jié)果

表3 金櫻子鞣質(zhì)試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析

由方差分析表3可見(jiàn)，該回歸模型P＜0.0001，表明該模型差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，失擬項(xiàng)P= 0.1068＞0.05，表明失擬項(xiàng)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而說(shuō)明該模型能對(duì)金櫻子鞣質(zhì)提取率進(jìn)行準(zhǔn)確分析和預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)B-料液比和C-超聲提取時(shí)間：P＜0.0001，表明差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；A-乙醇百分濃度：P=0.0002＜0.01，表明差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同理二項(xiàng)式B2和C2極其顯著；A2具有顯著性；交互項(xiàng)AB、BC和AC不顯著；說(shuō)明不同的提取工藝條件對(duì)金櫻子鞣質(zhì)提取率不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

根據(jù)所擬合的回歸模型，作相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖，考察所擬合的響應(yīng)曲面形狀，分析乙醇百分濃度、料液比和超聲提取時(shí)間對(duì)金櫻子鞣質(zhì)提取率的影響，其3D響應(yīng)曲面圖和等高線圖，見(jiàn)圖1～3。這3個(gè)圖較直觀地反映了乙醇百分濃度、料液比和超聲提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值鞣質(zhì)提取率的交互影響，同時(shí)等高線的形狀可反應(yīng)交互效應(yīng)的大小強(qiáng)弱，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形表示兩因素交互作用顯著。

運(yùn)用Design-Expert 7.0.0軟件對(duì)二項(xiàng)式回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，得最佳提取工藝為乙醇濃度71.02%，料液比1∶37.3，提取時(shí)間61.18 min，提取率預(yù)測(cè)的最大值6.19%。

圖1 乙醇濃度和料液比的3D響應(yīng)面圖和等高線圖

圖2 料液比和提取時(shí)間的3D響應(yīng)面圖和等高線圖

圖3 提取時(shí)間和乙醇濃度的3D響應(yīng)面圖和等高線圖

2.5驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

驗(yàn)證響應(yīng)曲面法所得到的最優(yōu)條件，檢驗(yàn)得到的結(jié)果是否可靠，在最佳條件下分別提取了3次（考慮到實(shí)際操作的情況，將鞣質(zhì)最佳提取條件修正為料液比1∶30、超聲時(shí)間為60 min、乙醇濃度為75%），提取溫度為50℃，結(jié)果金櫻子鞣質(zhì)平均提取率為6.10%，與預(yù)測(cè)值的偏差0.94%，偏差不大吻合較好，說(shuō)明優(yōu)選的提取超聲工藝預(yù)測(cè)性良好。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

超聲提取現(xiàn)已應(yīng)用于大部分植物化學(xué)成分的提?。?3］，利用超聲輻射產(chǎn)生的強(qiáng)烈擾動(dòng)效應(yīng)、空化效應(yīng)等多種效應(yīng)來(lái)增加物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度、頻率、溶劑的穿透力以及加速提取成分進(jìn)入溶劑，這樣就能避免高溫對(duì)提取成分造成的影響。鞣質(zhì)為結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多酚類(lèi)化合物［14］，是一類(lèi)熱不穩(wěn)定成分。因此本實(shí)驗(yàn)采用超聲波提取金櫻子中鞣質(zhì)，節(jié)能省時(shí)，且能有效地提高金櫻子鞣質(zhì)的提取率。

3.2 單因素的考察

通過(guò)單因素與星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法相結(jié)合的試驗(yàn)方法，對(duì)金櫻子中總鞣質(zhì)的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)選。因響應(yīng)面優(yōu)化的前提是所設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)應(yīng)包括較佳的實(shí)驗(yàn)條件，一旦實(shí)驗(yàn)點(diǎn)選取不當(dāng)，就不能得到較好的優(yōu)選結(jié)果。因此本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行星點(diǎn)設(shè)計(jì)之前，對(duì)可能影響金櫻子中鞣質(zhì)提取率的各因素分別進(jìn)行考察，確定了各個(gè)因素的較佳水平，并縮小了各因素的水平范圍，這對(duì)于通過(guò)效應(yīng)面法優(yōu)選較佳提取工藝有利，也有利于預(yù)測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

基于Design-Expert 7.0.0試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，通過(guò)二次回歸得到了金櫻子鞣質(zhì)提取率與乙醇百分濃度、液料比、超聲提取時(shí)間的二次回歸模型，經(jīng)方差分析得出該回歸模型是合理可靠的，能較好地預(yù)測(cè)金櫻子鞣質(zhì)提取率。再利用該模型的響應(yīng)面及其等高線直觀得出對(duì)影響金櫻子鞣質(zhì)提取率較大因素的相互作用，得到最優(yōu)工藝為：乙醇百分濃度為75%，超聲提取時(shí)間為60 min，液料比為1∶30，超聲提取溫度為50℃。因此，利用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)曲面法對(duì)金櫻子鞣質(zhì)超聲提取工藝進(jìn)行優(yōu)選，能獲得最優(yōu)的工藝條件，這樣能有效減少工藝操作的盲目性，簡(jiǎn)單易行、省時(shí)節(jié)能且提取效率高，為金櫻子鞣質(zhì)的開(kāi)發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)其他類(lèi)藥材中鞣質(zhì)的提取有著一定的參考依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.一部.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：206，附錄62，附屬XB.

［2］劉眾，高智席，李麗，等.金櫻子中蘆丁和槲皮素不同提取方法的比較研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（8）：4521-4522.

［3］劉學(xué)貴，李佳駱，高品一，等.藥食兩用金櫻子的研究進(jìn)展［J］.食品科學(xué)，2013，34（11）：392-398.

［4］鄭榮梁，黃中洋.自由基生物學(xué)［M］.北京：高等教育出版社，2007.

［5］Sharif T，Auger C，Alhosin M，et al.Red wine polyphenols cause growth inhibition and apoptosis in acute lymphoblastic leukaemia cells by inducing a redox-sensitive up-regulation of p73 and down-regulation of UHRFl［J］. Eur J Cancer，2010，46（5）：983-994.

［6］Kleijnen JPC，Hertog D，Angun E，et al.Response surface method-ology'S steepest ascent and stepsize revisited Crrection［J］.Eur J Operational Res，2006，17（1）：664.

［7］韓偉，劉傲霞，成悅，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)—效應(yīng)面優(yōu)化法在中藥提取中的應(yīng)用［J］.機(jī)電信息，2013，26（9）：1-5.

［8］王添敏，孫曉麗，彭雪，等.胡桃楸的根、莖枝、葉和果皮中總鞣質(zhì)的含量測(cè)定［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36（1）：32-36.

［9］俞文婕，王添敏，翟延君，等.星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)化胡桃楸莖枝中總鞣質(zhì)提取工藝［J］.中成藥，2013，35（7）：1419-1424.

［10］陳毅挺，林明峰，鄭水欽，等.翻白草中鞣質(zhì)的超聲提取工藝研究［J］.閩江學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31（2）：107-110.

［11］林芳花，彭永宏，沈翠霞，等.金櫻子鞣質(zhì)含量測(cè)定及其抗氧化提高生育力的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)野生植物資源，2012，31（4）：15-17.

［12］王坤，魯靜.中藥材中鞣質(zhì)含量測(cè)定方法的研究［J］.中國(guó)藥事，2004，18（6）：361-364.

［13］薛峰，李春娜，李明收，等.超聲提取在中藥化學(xué)成分提取中的應(yīng)用［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（18）：231-234.

［14］張愛(ài)武，劉樂(lè)樂(lè)，羅素琴，等.正交試驗(yàn)優(yōu)選蒙藥狗尾草果實(shí)中總鞣質(zhì)的提取工藝研究［J］.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35（3）：216-218.

Analysis of influence factors on extraction rate of tannin from Rosa Lae鄄vigatae Fructus and optimization of extraction condition

YAN Jianxin1，2WANG Xiaoli2▲
1.Department of Pharmacy,Guizhou People's Hospital,Guizhou Province,Guiyang550001,China;2.College of Pharmacy,Guiyang Medical University,Guizhou Province,Guiyang550004,China

ObjectiveTo optimize the process of ultrasonic extracting effective constituents from Rosa Laevigatae Fructus of tannin.MethodsThe content of tannin was determined by phosphomolybdotungsitc acid-UV spectmphotometry solvent.Based on single-factor tests,with ethanol percent,solid-liquid ratio,extraction time as independent variables and yield of tannin from Rosa Laevigatae Fructus as dependent variable,multiple linear regression and binomial fitting was adopted by central composite design model,and determine optimum extraction technology,and the forcast analysis was done.ResultsThe best extraction process was as followed:the concentration ethanol of 75%,ratio of solid-liquid of 1∶30,extraction time of 60 min,extraction temperature of 50℃.ConclusionThis optimized extraction process is simple and reliable,it can laid a certain foundation for development and utilization of tannins from Rosa Laevigatae Fructus.

Rosa Laevigatae Fructus;Tannin;Ultrasonic extraction;Response surface method

R284.2

A

1673-7210（2015)02（b)-0099-04

2014-11-14本文編輯：衛(wèi)軻）

貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開(kāi)發(fā)專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)：黔科合ZY字［2012］3004）。

▲通訊作者