新型維A酸ECPIRM及全反式維A酸對白細(xì)胞介素17刺激HaCaT細(xì)胞白細(xì)胞介素1β表達(dá)的影響

楊林芳 曹玉萍 張孟麗 馬鵬程 李玲珺 魏峻 陶蕾 劉維達(dá)

維A酸是維生素A類衍生物，利用其抗炎作用，治療包括銀屑病在內(nèi)的多種慢性炎癥性皮膚病。本課題組合成的新型維A酸類藥物derivativeN-（4-ethoxycarbonylphenyl）isoretinamide（ECPIRM，已申請專利，專利號：201310219734.4）主要通過非受體激活途徑，在發(fā)揮其抗炎作用的同時減輕臨床不良反應(yīng)。白細(xì)胞介素1（IL-1）家族在免疫調(diào)節(jié)和炎癥過程中扮演重要角色，在銀屑病等炎癥性皮膚病中表達(dá)量升高［1］。角質(zhì)形成細(xì)胞在調(diào)節(jié)炎癥過程中起重要作用，Th17細(xì)胞的產(chǎn)物IL-17刺激角質(zhì)形成細(xì)胞IL-1β上調(diào)，加重皮膚炎癥［2］。本研究通過觀察IL-17對HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β的干預(yù)作用，探討IL-17對HaCaT細(xì)胞IL-1β表達(dá)的影響，以及ECPIRM及ATRA對IL-17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL-1β表達(dá)的干預(yù)作用。

材料與方法

一、材料

永生化人角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞（本實(shí)驗(yàn)室保存），ECPIRM（本課題組合成），IL-17（美國Peprotech公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物公司），MTT（美國Sigma-Aldrich公司），Trizol（美國 Life Technologies公司），SYBR green實(shí)時熒光定量PCR檢測試劑盒（大連TaKaRa公司），人IL-1β定量ELISA試劑盒（聯(lián)科生物技術(shù)有限公司），全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），GeneAmp PCR System 9700（美國 ABI公司）熒光定量PCR儀（美國ABI）。

（1）通風(fēng)：是豬舍降溫放熱的有效措施，即可排除舍內(nèi)的熱量，又能改善空氣污濁度，保持舍內(nèi)空氣新鮮。實(shí)際生產(chǎn)中要依據(jù)舍內(nèi)空氣質(zhì)量和溫濕度的情況，適時通風(fēng)換氣。

二、方法

為了與原方案對比，仍采用原來的刀盤網(wǎng)格模型，用原先的單元尺寸對異形刀片重新劃分網(wǎng)格，并和刀盤網(wǎng)格模型組合后形成優(yōu)化方案3的CFD模型。設(shè)置相同的邊界條件，待流場穩(wěn)定后測得一個旋轉(zhuǎn)周期內(nèi)刀片上的扭矩，如圖14所示。

ECPIRM對HaCaT細(xì)胞的抑制生長作用具有濃度及時間依賴性（表2）。24 h時，低濃度ECPIRM（20、40 μmol/L）對HaCaT細(xì)胞具有促進(jìn)增殖的作用，80 μmol/L ECPIRM對HaCaT細(xì)胞生長沒有影響；隨著ECPIRM濃度增高，抑制HaCaT細(xì)胞生長。48 h 時，ECPIRM（20、40 μmol/L）對 HaCaT 細(xì)胞生長沒有影響，隨著濃度升高出現(xiàn)抑制。72 h時，各濃度ECPIRM均抑制HaCaT細(xì)胞生長。以下實(shí)驗(yàn)選擇80 μmol/L ECPIRM。

寧夏十年九旱，是我國極度干旱缺水的地區(qū)之一。多年平均降水量289 mm，蒸發(fā)量1 250 mm。當(dāng)?shù)厮Y源量少質(zhì)差、時空分布不均。全區(qū)水資源總量11.63億m3，其中地表水資源量9.49億m3。經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展主要依賴于國家限量分配的黃河水，全區(qū)水資源可利用量41.5億m3，人均占有量687m3，不足全國平均值的1/3。按自然地理特點(diǎn)、經(jīng)濟(jì)狀況，全區(qū)大體分為北部引黃灌區(qū)、中部干旱帶和南部山區(qū)。

5.RT-PCR檢測IL-1β mRNA相對表達(dá)水平：采用Trizol法提取HaCaT細(xì)胞總RNA，測定純度并定量后反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。IL-β 上游引物 5′-TTACAGTGGCAATGAGGATGA C-3′，下游引物 5′-GTGGTGGTCGGAGATTCGTA-3′；內(nèi)參照β肌動蛋白上游引物5′-TAGTTGCGTTACA CCCTTTCTTG-3′，下游引物 5′-TCACCTTCACCGT TCCAGTTT-3′，反應(yīng)條件：預(yù)變性 95 ℃ 10 min，變性 95℃ 15 s，退火 60 ℃ 30 s，延伸 72℃ 30 s，循環(huán)數(shù) 40。采用 2-ΔΔCt法，ΔCt= 目的基因 Ct值 - β 肌動蛋白Ct值；ΔΔCt=樣品ΔCt-對照樣品ΔCt。以對照組目的基因表達(dá)量為1，2-△△Ct值即為實(shí)驗(yàn)組目的基因較對照組目的基因表達(dá)的倍數(shù)。

當(dāng)時，火鍋的質(zhì)地有陶瓷、純銀、銀鍍金、銅、錫、鐵數(shù)種。其基本形式有兩種：一種為組合式，由鍋、爐支架、爐圈、爐盤、酒精碗5部分組成，可以同時上桌燒煮食物，也可單獨(dú)用鍋溫食品。另一種為鍋中帶爐，爐內(nèi)燒炭火，能把水燒開，生魚、生肉、蔬菜等放入沸水中可以煮熟。

3.MTT法檢測細(xì)胞增殖活性：96孔板中各組細(xì)胞培養(yǎng)完畢后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37℃避光孵育4 h后棄上清液，加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），振蕩儀上低速振蕩10 min。酶標(biāo)儀490 nm處測定各孔A值。

二、ECPIRM對IL-17刺激HaCaT細(xì)胞IL-1β蛋白表達(dá)的影響

結(jié) 果

一、MTT法檢測不同藥物濃度對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響

ATRA對HaCaT細(xì)胞具有抑制生長的作用，并有濃度及時間依賴性（表 1），其中 1 μmol/L 及 5 μmol/LATRA作用24 h對細(xì)胞增殖沒有影響，以下實(shí)驗(yàn)選擇 5 μmol/L ATRA。

1.細(xì)胞培養(yǎng)：HaCaT細(xì)胞在含10%胎牛血清及1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，37℃5%CO2條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞單層鋪滿培養(yǎng)瓶以后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗1次，加0.25%胰蛋白酶消化液，待鏡下細(xì)胞呈圓形時加DMEM培養(yǎng)基終止消化，細(xì)胞收集于離心管中，40×g離心4 min，棄上清液，重懸于DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

表1 不同濃度全反式維A酸（ATRA）對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響（A值，±s）

表1 不同濃度全反式維A酸（ATRA）對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響（A值，±s）

注：n=5。與對照組相比，a：P ＜ 0.05

2 4 h 4 8 h 7 2 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）對照組 0.5 4 5±0.0 0 6 - 0.8 5 5±0.0 2 0 - 1.5 1 2±0.0 2 0 -1 μ m o l/L A T R A 0.5 4 4±0.0 0 8 0.2 3 0.8 2 2±0.0 6 0 a 4.4 1 1.3 0 9±0.0 2 0 a 1 4.3 6 5 μ m o l/L A T R A 0.5 4 3±0.0 0 5 1.4 8 0.7 8 7±0.0 1 0 a 8.8 4 1.2 4 3±0.0 2 0 a 1 9.9 2 1 0 μ m o l/L A T R A 0.5 2 9±0.0 0 8 a 4.4 5 0.7 5 1±0.0 2 0 a 1 4.6 3 1.1 9 3±0.0 1 0 a 2 3.3 9 5 0 μ m o l/L A T R A 0.4 7 2±0.0 0 7 a 1 7.0 3 0.6 2 6±0.0 2 0 a 2 9.7 9 1.0 3 2±0.0 6 0 a 3 5.7 3 1 0 0 μ m o l/L A T R A 0.4 0 6±0.0 0 3 a 3 1.2 8 0.5 5 3±0.0 3 0 a 3 9.3 4 0.8 9 8±0.0 3 0 a 4 3.2 3 F值 3 9.3 5 1 9.7 1 2 0.0 4 P值 ＜0.0 5 ＜0.0 5 ＜0.0 5組別

表2 不同濃度新型維A酸ECPIRM對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響（A值，±s）

表2 不同濃度新型維A酸ECPIRM對HaCaT細(xì)胞增殖活力的影響（A值，±s）

注：n=5。與對照組相比，a：P ＜ 0.05

2 4 h 4 8 h 7 2 h A值 抑制率（%） A值 抑制率（%） A值 抑制率（%）對照組 0.5 6 9±0.0 1 4 - 0.8 1 7±0.0 2 0 - 1.3 1 2±0.0 1 0 -2 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 8 2±0.0 0 3 a -3.1 0 0.8 2 0±0.0 2 0 0.3 3 1.1 8 8±0.0 3 0 a 1 0.1 8 4 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 8 4±0.0 0 3 a -3.9 1 0.8 1 8±0.0 2 0 0.0 6 0.9 2 9±0.0 2 0 a 3 1.2 9 8 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 6 8±0.0 0 9 0.4 6 0.7 6 3±0.0 3 0 7.4 1 0.6 6 1±0.0 3 0 a 5 3.1 4 1 6 0 μ m o l/L E C P I R M 0.5 2 3±0.0 0 2 a 9.6 1 0.4 4 1±0.0 2 0 a 5 1.5 4 0.3 0 2±0.0 3 0 a 8 2.5 4 3 2 0 μ m o l/L E C P I R M 0.3 6 1±0.0 0 9 a 4 3.3 5 0.1 5 1±0.0 2 0 a 9 1.2 7 0.1 8 3±0.0 1 0 a 9 3.2 3 F值 5 7.1 4 7 4.6 7 7 7.3 6 P值 ＜0.0 5 ＜0.0 5 ＜0.0 5組別

2.實(shí)驗(yàn)分組：MTT實(shí)驗(yàn)分為ECPIRM組、ATRA組、IL-17組、ECPIRM+IL-17組及 ATRA+IL-17組。不同濃度 ECPIRM 組（20、40、80、160、320μmol/L）及 ATRA 組（1、5、10、50、100 μmol/L）分別作用 24、48 及 72h，IL-17（20μg/L）組作用 24h，IL-17（20μg/L）+ECPIRM（80 μmol/L）組作用 24 h，IL-17（20 μg/L）+ATRA（5 μmol/L）組作用 24 h，同時設(shè)對照組（加等量的IL-17溶解液）。24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液并提取細(xì)胞總RNA進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

80μmol/L ECPIRM及5μmol/LATRA與20μg/L IL-17作用于HaCaT細(xì)胞后，對照組、IL-17組、ATAR+IL-17組、ECPIRM+IL-17組細(xì)胞增殖活力（A值）分別為1.312±0.011、1.316±0.014、1.297±0.024、1.230 ± 0.014，經(jīng)單因素方差分析，F(xiàn)=1.702，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

4.IL-1β的含量測定：離心收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用IL-1β ELISA試劑盒檢測，按照說明書步驟操作，實(shí)驗(yàn)完成后用酶標(biāo)儀測定A值，根據(jù)測定結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出各組樣品中IL-1β含量。

是的，是有過。因?yàn)槲液湍信笥岩淮纬臣?，他失手推倒我，孩子沒出生就夭折。那個時候我脾氣暴戾，我們?yōu)榱诵∈戮涂梢源蟠虺鍪?，過后又會互相乞求對方原諒，糾纏著愛著生活著，并想著永遠(yuǎn)。男朋友在我們相處的第三個年頭得了脊柱結(jié)核，動完手術(shù)之后癱瘓?jiān)诖?，醫(yī)生說他有可能這輩子都站不起來，我照顧了他兩年，有好轉(zhuǎn)的跡象，腿已經(jīng)能活動，就在我們歡歡喜喜準(zhǔn)備出院的前一天，他用水果刀刺穿了自己的心臟。是因?yàn)橐呀?jīng)能夠活動的腿突然又喪失了知覺。他再也忍受不了這樣的屈辱，所以，拋棄了親人，放棄了愛人。

見表3。與對照組比較，IL-17可上調(diào)HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β蛋白的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ECPIRM+IL-17組及 ATRA+IL-17組 IL-1β蛋白的表達(dá)下降，與IL-17組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組與ECPIRM+IL-17組及ATRA+IL-17組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

幾何教學(xué)的目的在于系統(tǒng)地研究平面上和空間物體圖形的性質(zhì)，并利用這些性質(zhì)去解決計(jì)算題和作圖題；在于發(fā)展學(xué)生的邏輯的思維和對于空間的想象力，并使他們能運(yùn)用所學(xué)到的知識去解決實(shí)際問題：在當(dāng)?shù)剡M(jìn)行測量，測定各種建筑物的面積和容積，作應(yīng)用于軍事方面的簡單測量等等.

表3 ECPIRM、ATRA及IL-17對HaCaT細(xì)胞IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)的影響（±s）

表3 ECPIRM、ATRA及IL-17對HaCaT細(xì)胞IL-1β蛋白及mRNA表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。ECPIRM：新型維A酸；ATRA：全反式維A酸；IL-17：白細(xì)胞介素17。a：與IL-17組相比，P＜0.05；b：與對照組相比，P＜0.05；c：與ECPIRM及ATRA干預(yù)組相比，P＜0.05

組別I L-1 β（n g/L）I L-1 β m R N A（2-△△Ct）對照組 1 1.4 2 7±0.9 2 9 a 1.0 0±0.0 3 a I L-1 7組 2 0.3 1 2±2.0 5 3 bc 4.0 5±0.4 7 bc E C P I R M+I L-1 7組 1 2.4 7 0±1.8 9 7 a 0.8 2±0.1 2 a A T R A+I L-1 7組 1 2.6 9 4±1.4 7 8 a 0.8 7±0.1 8 a F值 2 4.6 8 2 1.0 1 P值 ＜0.0 5 ＜0.0 5

三、ECPIRM對IL-17刺激HaCaT細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)的影響

見表3。IL-17組與對照組比較，HaCaT細(xì)胞IL-1β mRNA表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；ECPIRM+IL-17組及 ATRA+IL-17 組 IL-1β mRNA表達(dá)下降，與IL-17組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組、ECPIRM+IL-17組及ATRA+IL-17組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚炎癥性疾病如銀屑病發(fā)病過程中重要的一環(huán)，它可通過產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和化學(xué)因子而發(fā)揮作用。IL-1β在皮膚炎癥性疾病的致病中發(fā)揮重要作用［3］，包括銀屑病、特應(yīng)性皮炎［4-5］等。有報道將IL-1β拮抗劑gevokizumab應(yīng)用于泛發(fā)型膿皰性銀屑病取得較好療效［6］。Th17細(xì)胞與銀屑病、特應(yīng)性皮炎等慢性皮膚炎癥性疾病的發(fā)病密切相關(guān)［7］，IL-17是Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，參與銀屑病的致病過程并參與角質(zhì)形成細(xì)胞的多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，它可以通過上調(diào)促炎介質(zhì)、中性粒細(xì)胞趨化因子和炎癥趨化因子，活化T細(xì)胞跨越胞外域參與機(jī)體炎癥反應(yīng)［8］。

維A酸通過調(diào)節(jié)天然免疫和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的功能，抑制各種炎癥因子釋放，參與機(jī)體的炎癥活動［9］。有報道全反式維A酸ATRA在炎癥發(fā)生時對穩(wěn)定人類天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞起到關(guān)鍵作用，通過抑制人類天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞向Th1和（或）Th17細(xì)胞轉(zhuǎn)化，抑制IL-1和IL-6配體功能發(fā)揮作用，成為一種控制免疫介導(dǎo)的慢性自身免疫性疾病和炎癥性疾病的治療方向［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，ATRA可抑制由IL-17刺激誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL-1β的表達(dá)。維A酸通過與HaCaT細(xì)胞表面的維A酸受體（RAR、RXR）結(jié)合引發(fā)系列生物學(xué)效應(yīng)［11］，ATRA 通過激活RAR抑制炎癥環(huán)境中炎癥因子TNF-α及IL-6的分泌［12］。另有實(shí)驗(yàn)報道，9-cis-RA通過與RXR結(jié)合抑制由高糖引起的人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）及血管細(xì)胞間黏附分子1（VCAM-1）的產(chǎn)生［13］。另一方面維A酸受體的表達(dá)及激活與臨床不良反應(yīng)相關(guān)，為了減少不良反應(yīng)的發(fā)生，我們嘗試應(yīng)用非受體激活的新型維A酸衍生物來探究其影響及作用機(jī)制。ECIRM是以13-cis-RA為原料合成，前期研究表明，其作用過程中對RAR和RXR均無明顯的激活作用［14］。提示除了受體依賴途徑外，維A酸尚能通過非受體依賴途徑抑制炎癥因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗炎作用。本研究中，根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們選擇對HaCaT細(xì)胞生長無影響的ECPIRM及ATRA藥物濃度。結(jié)果提示，IL-17可促進(jìn)HaCaT細(xì)胞分泌IL-1β，ECPIRM及ATRA均可以抑制由IL-17誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞IL-1β的表達(dá)。上述結(jié)果可為多種慢性炎癥性皮膚病提供新的治療思路和理論依據(jù)，但更深入詳盡的作用機(jī)制仍待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

［1］Balato A,Schiattarella M,Lembo S,et al.Interleukin-1 family members are enhanced in psoriasis and suppressed by vitamin D and retinoic acid［J］.Arch Dermatol Res,2013,305（3）:255-262.

［2］Cho KA,Suh JW,Lee KH,et al.IL-17 and IL-22 enhance skin inflammation by stimulating the secretion of IL-1β by keratinocytes via the ROS-NLRP3-caspase-1 pathway［J］.Int Immunol,2012,24（3）:147-158.

［3］Murphy JE,Robert C,Kupper TS.Interleukin-1 and cutaneous inflammation:a crucial link between innate and acquired immunity［J］.J Invest Dermatol,2000,114（3）:602-608.

［4］Bebes A,Kovács-Sólyom F,Prihoda J,et al.Interleukin-1 receptors are differentially expressed in normal and psoriatic T cells［J］.Mediators Inflamm,2014,2014:472625.

［5］Abramovits W,Rivas Bejarano JJ,Valdecantos WC.Role of interleukin 1 in atopic dermatitis［J］.Dermatol Clin,2013,31（3）:437-444.

［6］Mansouri B,Richards L,Menter A.Treatment of two patients with generalised pustular psoriasis with the interleukin-1β inhibitor gevokizumab ［J］.Br J Dermatol,2014:［2015-04-28］.http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/bjd.13614/epdf

［7］Miyagaki T,Sugaya M.Recent advances in atopic dermatitis and psoriasis:Genetic background,barrier function,and therapeutic targets［J］.J Dermatol,2015,78（2）:89-94.

［8］Koga C,Kabashima K,Shiraishi N,et al.Possible Pathogenic Role of Th17 Cells for Atopic Dermatitis［J］.J Invest Dermatol,2008,128（11）:2625-30.

［9］Raverdeau M,Mills KH.Modulation of T Cell and Innate Immune Responses by Retinoic Acid［J］.J Immunol,2014,192（7）:2953-2958.

［10］Lu L,Lan Q,Li Z,et al.Critical role of all-trans retinoic acid in stabilizing human natural regulatory T cells under inflammatory conditions［J］.Proc Natl Acad Sci U S A,2014,111（33）:E3432-3440.

［11］Hans T,Ola R.The vitamin A metabolism and expression of retinoid-binding proteins differ in HaCaT cells andnormal human keratinocytes［J］.Arch Dermatol Res,1999,291（6）:339-345.

［12］Klassert TE,Hanisch A,Br?uer J,et al.Modulatory role of vitamin A on the Candida albicans-induced immune response in humanmonocytes［J］.Med Microbiol Immunol,2014,203（6）:415-424.

［13］Ning R B,Zhu J,Chai D J,et al.RXR agonists inhibit high glucose-induced upregulation of inflammation by suppressing activation of the NADPH oxidase-nuclear factor-κB pathway in human endothelial cells［J］.Genet Mol Res,2013,12（4）:6692-6707.

［14］Zhang M,Tao Y,Ma P,et al.Synthesis and characterization of a new retinoic acid ECPIRM as potential chemotherapeutic agent for human cutaneous squamous carcinoma ［J］.Anticancer Agents Med Chem,2015,15（9）:1204-1212.