大孔樹脂純化瓜馥木總黃酮工藝及抗抑郁活性研究

傅春燕，劉永輝，楊 林，陳 波

1 邵陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校;2 湖南省新邵縣紅十字會醫(yī)院，邵陽 422000;3湖南師范大學(xué)化學(xué)生物學(xué)及中藥分析教育部重點實驗室，長沙 410081

瓜馥木［Fissistigma oldhamii(Hemsl.)Merr.］，又名鐵牛鉆石、鉆山風(fēng)、香藤，為番荔枝科(Annonaceae)馥木屬(Fissistigma griffi.)植物，是廣西藥材“十八鉆”中的“鐵鉆”。根和藤莖入藥，性溫味辛，具有祛風(fēng)除濕、活血止痛等功效，用于跌打損傷、關(guān)節(jié)炎、腰痛、胃痛及坐骨神痛的治療［1］。瓜馥木中富含黃酮類化合物、生物堿等活性成分［2］。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗炎、抗菌等活性［3］，天然來源黃酮類成分還具有廣泛抗抑郁活性［4-7］。在前期研究中，本課題組對瓜馥木總黃酮的最佳提取工藝進行了研究，并報道了瓜馥木富集純化的總黃酮部位具有較強的清除自由基能力［8］。在此基礎(chǔ)上，本實驗以瓜馥木總黃酮為研究對象，首次報道篩選了5種大孔樹脂分離純化瓜馥木總黃酮的工藝，并進行了總黃酮抗抑郁活性的測試，為進一步研究瓜馥木黃酮類化合物奠定理論基礎(chǔ)，為開發(fā)新結(jié)構(gòu)及新作用的高效低毒抗抑郁劑提供新的思路。

1 材料與儀器

瓜馥木藥材2011 年8 月采自廣西臨桂，由廣西師范大學(xué)生命科學(xué)院唐紹清教授鑒定為瓜馥木藤莖［F.oldhamii(Hemsl.)Merr.］。蘆丁對照品(純度≥98%，HPLC，批號:080-9303)，中國藥品生物制品檢定所提供;其他試劑均為市售分析純。電子天平(沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司);TU-1901 雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);AB-8、HPD-600、HPD-826、X-5 和D4006 型大孔吸附樹脂購自天津南開大學(xué)化工廠。雄性ICR 小鼠，5周齡，體重20～22 g，由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院提供［生產(chǎn)許可證號:SCXK(湘)2013-0004］。

2 實驗方法

2.1 大孔樹脂預(yù)處理

選擇五種大孔吸附樹脂作為考察對象，分別為:AB-8、HPD-600、HPD-826、X-5 和 D4006。按 文獻［9-11］報道預(yù)處理方法:各種型號樹脂用95%乙醇浸泡12 h 后，濕法裝柱，用95%乙醇4 BV 動態(tài)清洗，再用水洗至無醇味;依次用5%鹽酸(浸泡3 h后，3 BV 清洗，水洗至中性)和5% NaOH(浸泡3 h后，3 BV 清洗，然后水洗至中性)處理;最后用95%乙醇清洗至乙醇洗脫液與水混合(1∶5)不呈白色混濁為止;用水洗至無醇味，備用。

2.2 上樣液制備

將瓜馥木藤莖于60 ℃干燥烘干，粉碎，過60目。精密稱取一定量瓜馥木藥材粉末，按本課題組的工藝提取(即提取時間3 h，乙醇濃度90%，固液比1∶10，提取溫度為70 ℃)［8］，趁熱過濾，減壓回收溶劑至無醇味，殘留物加藥材10 倍量水超聲分散，離心，即得濃度1.0 g 生藥材/mL 的上樣液，備用。

2.3 考察指標(biāo)

樹脂的吸附量是評價樹脂性能的一項重要指標(biāo)［12］。以樹脂對總黃酮的吸附量、吸附-解吸率以及洗脫物中總黃酮的含量作為考察指標(biāo)，優(yōu)選純化瓜馥木總黃酮的最佳樹脂。

2.3.1 動態(tài)吸附量考察

取5 種不同型號大孔樹脂(AB-8、X-5、D4006、HPD-826、HPD-600)各20 mL，裝入色譜柱，測定死體積后，將濃度為1.0 g 生藥材/mL 樣品液分別通過樹脂柱，以1.0 mL/min 流速進行動態(tài)吸附，流出液每10 mL 收集1 份，用HCl-Mg 反應(yīng)檢測，待顯色反應(yīng)呈明顯陽性時，停止上樣，記錄上樣量，并計算總黃酮吸附量。

2.3.2 吸附-解析率測定

取“2.3.1 動態(tài)吸附量測定”項下樹脂柱用蒸餾水清洗除雜，50%乙醇洗脫至無色。收集50%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，稱重。取50%乙醇洗脫物適量，按瓜馥木總黃酮含量測定方法［8］分別測定洗脫物中總黃酮含量，計算吸附-解析率［13-15］。

2.4 試驗設(shè)計

選擇大孔樹脂的吸附條件優(yōu)化(吸附濃度、吸附流速、樹脂床徑高比、泄漏曲線)、除雜條件優(yōu)化(除雜溶劑、除雜體積)和洗脫條件優(yōu)化(洗脫劑、洗脫流速、洗脫曲線)幾個單因素水平分析來考察瓜馥木總黃酮最佳純化工藝，最后采用工藝驗證試驗確定最佳純化工藝條件。

2.5 瓜馥木總黃酮抗抑郁作用的研究

將小鼠60 只隨機分為五組，分別為空白對照組，陽性藥鹽酸氟西汀膠囊5 mg/kg 給藥組，瓜馥木總黃酮50、100、150 mg/kg 三個劑量給藥組，每天給藥一次，連續(xù)給藥10 d，空白對照組同時給以同體積的1%羧甲基纖維素鈉水溶液20 mL/kg。末次給藥后1 h，開始檢測。

2.5.1 小鼠強迫游泳試驗

根據(jù)Porsolt 建立的方法［16］，加以改進。末次給藥后1 h，將小鼠分別置于溫度25±1 ℃、深度10 cm 的水中強迫游泳6 min。先適應(yīng)2 min，記錄后4 min 內(nèi)小鼠累計不動時間。判定不動的標(biāo)準(zhǔn)是動物在水中停止掙扎，呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運動以保持頭部浮在水面。

2.5.2 小鼠懸尾試驗

根據(jù)Lucien Steru 等建立的方法［17］，加以改進。末次給藥后1 h，分別將小鼠尾部2 cm 處的部分固定于自制的懸尾支架上，使小鼠呈倒掛狀態(tài)，其頭部離臺面約5 cm，每只動物兩側(cè)用板隔開，遮擋動物視線，使之互相不干擾。觀察各組動物在6 min 之內(nèi)后5 min 的累計不動時間。判定不動的標(biāo)準(zhǔn)是動物在停止掙扎，身體呈垂直倒懸狀態(tài)，靜止不動。

2.5.3 小鼠自主運動實驗

使用小鼠自由活動計時器，儀器分為4 個直徑15 cm 的圓柱形暗室，小鼠給藥30 min 后，每個暗室放1 只，儀器自動記錄5 min 內(nèi)小鼠自主運動情況。動物給藥方法與劑量均與活性實驗一致。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

每組樣本以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析比較各組間的差異，然后用GraphPad Software(Version 4.0)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 指標(biāo)考察

動態(tài)吸附量考察和吸附-解析率測定結(jié)果見表1。

表1 不同樹脂動態(tài)吸附量、吸附-解析率、含量測定結(jié)果Table 1 Results of dynamic adsorption quantity，adsorption-desorption and content with different resins

由總黃酮吸附量、吸附-解析率、含量可知，AB-8型樹脂明顯優(yōu)于其他樹脂，故選擇AB-8 型大孔吸附樹脂作為瓜馥木總黃酮純化工藝用樹脂。

3.2 AB-8 型大孔吸附樹脂純化工藝優(yōu)化

3.2.1 吸附條件優(yōu)化

3.2.1.1 吸附濃度考察

對上述瓜馥木的提取液減壓回收溶劑至無醇味，殘留物加水超聲分散，離心，配制成表2 所述各濃度上樣液，分別通過AB-8 型大孔吸附樹脂柱(樹脂體積20 mL)，吸附流速1.0 mL/min，進行動態(tài)吸附。HCl-Mg 反應(yīng)監(jiān)測流出液，反應(yīng)呈明顯陽性時，停止上樣，記錄上樣量，計算總黃酮吸附量。樹脂柱用蒸餾水清洗除雜，50% 乙醇洗脫至無色。收集50%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，稱重。分別測定洗脫物中總黃酮含量，并計算吸附-解析率。結(jié)果見表2。

表2 吸附濃度對瓜馥木總黃酮吸附-解析率和含量的影響Table 2 Effect of adsorption concentration on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

由上表可知，上樣液濃度為1.0 g 生藥材/mL時，總黃酮吸附-解析率和含量優(yōu)于其他濃度，故最終選擇上樣液的濃度為1.0 g 生藥材/mL。

3.2.1.2 吸附流速考察

將濃度為1.0 g 生藥材/mL 的樣品液通過AB-8型樹脂柱，分別以1.0、2.0、3.0 mL/min 的流速進行動態(tài)吸附。用HCl-Mg 反應(yīng)監(jiān)測流出液，待反應(yīng)呈明顯陽性時，停止上樣，記錄上樣量，計算總黃酮比吸附量。樹脂柱用蒸餾水水清洗除雜，50%乙醇洗脫至無色。收集50%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，稱重。取50%乙醇洗脫物適量，分別測定洗脫物中總黃酮含量，計算吸附-解析率。結(jié)果見表3。

表3 吸附流速對瓜馥木總黃酮吸附-解析率和含量的影響Table 3 Effect of adsorption velocity on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

由表3 可知，流速為1.0 mL/min 時，總黃酮吸附-解析率和含量優(yōu)于其他濃度，故最終選擇上樣液的濃度為1.0 mL/min。

3.2.1.3 樹脂床徑高比考察

選擇相同直徑(2.0 cm)色譜柱3 根，填裝AB-8型樹脂使樹脂床徑高比分別為1∶5、1∶7、1∶9。取濃度為1.0 g 生藥材/mL 的樣品液通過樹脂柱，進行動態(tài)吸附。用HCl-Mg 反應(yīng)監(jiān)測流出液，待反應(yīng)呈明顯陽性時，停止上樣，記錄上樣量，計算總黃酮比吸附量。樹脂柱用蒸餾水水清洗除雜，50%乙醇洗脫至無色。收集50%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，稱重。取50%乙醇洗脫物適量，分別測定洗脫物中總黃酮含量，計算吸附-解析率。結(jié)果見表4。

表4 樹脂床徑高比對瓜馥木總黃酮吸附-解析率和含量的影響Table 4 Effect of diameter height ratio of resin bed on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

由上表可知，樹脂床徑高比為1∶5 和1∶7 時的含量和吸附-解析率明顯優(yōu)于1∶9 的含量和吸附解析率，1∶7 的含量和吸附-解析率比1∶5 較好，最終確定徑高比為1∶7。

3.2.1.4 泄漏曲線考察

按上述所確定的吸附條件，取樣品液通過AB-8型樹脂床(徑高比為1∶7)，吸附流速為1.0 mL/min，進行動態(tài)吸附，流出液每10 mL 收集一份，共收集20 份，每份流出液取一定體積，HCl-Mg 比色法測定總黃酮量并計算泄漏量。以每份總黃酮泄漏率為縱坐標(biāo)，累計上樣體積(mL)為橫坐標(biāo)繪制泄漏曲線。

圖1 AB-8 大孔樹脂純化瓜馥木總黃酮泄漏曲線Fig.1 Leak curve of total flavonoids from F.oldhamii with AB-8 resins

由泄漏曲線(圖1)可知，在上述吸附條件下，上樣體積為550 mL 時，總黃酮開始泄漏明顯。

3.2.2 除雜條件優(yōu)化

3.2.2.1 除雜溶劑考察

取濃度為1.0 g 生藥材/mL 的上樣液550 mL，按已確定的最佳吸附條件進行動態(tài)吸附，待吸附完成后，樹脂柱先分別用蒸餾水、5%乙醇和10%乙醇洗脫，再用50%乙醇洗脫至無色。收集50%乙醇洗脫液，蒸干，稱重，測定總黃酮含量，計算吸附-解吸率。結(jié)果見表5。

由表5 可知，用5%乙醇溶劑除雜時，洗脫物總黃酮含量和吸附-解析率最高，因此確定除雜溶劑為5%乙醇。

3.2.2.2 除雜體積確定

取濃度為1.0 g 生藥材/mL 的上樣液550 mL，按已確定的最佳吸附條件進行動態(tài)吸附，待吸附完成后，樹脂柱先分別用5%乙醇5 倍、7 倍、9 倍體積洗脫，再用50%乙醇洗脫至無色。收集50%乙醇洗脫液，蒸干，稱重，測定總黃酮含量，計算吸附-解吸率。結(jié)果見表6。

表5 不同除雜溶劑對瓜馥木總黃酮吸附-解析率和含量的影響Table 5 Effect of different mixed solvent on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

表6 除雜體積對瓜馥木總黃酮吸附-解析率和含量的影響Table 6 Effect of mixed solvent multiple on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

由表6 可知，用7 倍5%乙醇除雜時，洗脫物總黃酮含量和吸附-解析率最高，因此確定除雜溶劑用量為7 倍。

3.2.3 洗脫條件優(yōu)化

3.2.3.1 洗脫劑考察

取濃度為1.0 g 生藥材/mL 的上樣液550 mL，按已確定的最佳吸附條件進行動態(tài)吸附，待吸附完成后，樹脂柱用5%乙醇7 BV 進行除雜，再分別用50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇洗脫至無色，洗脫流速為1.0 mL/min。分別收集洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，測定總黃酮含量，計算吸附-解析率。結(jié)果見表7。

表7 洗脫劑對瓜馥木總黃酮吸附-解析率和含量的影響Table 7 Effect of eluent on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

從表7 數(shù)據(jù)可知，用50%乙醇洗脫時，洗脫物總黃酮含量和吸附-解析率最高，故確定洗脫溶劑為50%乙醇。

3.2.3.2 洗脫流速考察

取濃度為1.0 g 生藥材/mL 的上樣液550 mL，分別通過3 根AB-8 型樹脂床，按已確定的吸附及除雜條件操作，然后用50%乙醇洗脫至無色，洗脫流速分別為1.0、2.0、3.0 mL/min。收集50%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，稱重，測定總黃酮含量，計算吸附-解析率。結(jié)果見表8。

表8 洗脫流速對瓜馥木總黃酮吸附-解析率和含量的影響Table 8 Effect of elution velocity on adsorption-desorption rate and content of total flavonoids from F.oldhamii

從表8 數(shù)據(jù)可知，洗脫流速1.0 mL/min 時，洗脫物總黃酮含量最高，總黃酮吸附-解析率較高。從總黃酮含量考慮，故確定洗脫流速為1.0 mL/min。

3.2.3.3 洗脫曲線考察

取濃度為1.0 g 生藥材/mL 的樣品液通過AB-8 型樹脂柱，按已確定的吸附、除雜和洗脫條件操作，等體積收集洗脫液(每20 mL 收集一份)，共收集10 份。洗脫液完全轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，蒸干溶劑并減壓干燥，測定總黃酮量，計算洗脫量。以洗脫量為縱坐標(biāo)，洗脫液體積為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線，見圖2。

圖2 AB-8 大孔樹脂純化瓜馥木總黃酮的洗脫曲Fig.2 Elution curve of total flavonoids from F.oldhamii with AB-8 resin

由洗脫曲線可知，當(dāng)用50%乙醇洗脫120 mL時，總黃酮基本洗脫完全，因此確定洗脫體積為120 mL。

3.3 工藝驗證試驗

瓜馥木總黃酮最佳純化工藝為:提取物上樣液濃度為1.0 g 生藥材/mL，吸附流速為1.0 mL/min，樹脂床徑高比為1∶7，最大上樣量為550 mL，除雜溶劑為5%乙醇，除雜溶劑用量為140 mL(7 BV)，洗脫溶劑為50%乙醇，洗脫流速為1.0 mL/min，洗脫體積為160 mL(8 BV)，收集50%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，得瓜馥木總黃酮。按上述工藝條件制備3 批樣品，結(jié)果見表9。

表9 3 批樣品瓜馥木總黃酮含量測定結(jié)果Table 9 Results of total flavonoids content in three batches samples(%;n=3)

3.4 瓜馥木總黃酮抗抑郁活性研究

3.4.1 對小鼠強迫游泳行為的影響

由表10 結(jié)果可見，陽性藥鹽酸氟西汀膠囊、瓜馥木總黃酮50 mg/kg 劑量給藥組能明顯縮短小鼠強迫游泳累積不動時間。

表10 瓜馥木總黃酮對小鼠強迫游泳行為的影響(±S)Table 10 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on the duration of immobility in the forced swimming test(±S)

表10 瓜馥木總黃酮對小鼠強迫游泳行為的影響(±S)Table 10 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on the duration of immobility in the forced swimming test(±S)

注:與對照組比較，* P＜0.05，＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05，＊＊P＜0.01.

3.4.2 瓜馥木總黃酮對小鼠懸尾行為的影響

由表11 結(jié)果可見，陽性藥鹽酸氟西汀、瓜馥木總黃酮50、100 mg/kg 2 個劑量給藥組均能明顯縮短懸尾小鼠累計不動時間。

表11 瓜馥木總黃酮對小鼠懸尾行為的影響(±S)Table 11 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on the duration of immobility in tail suspension test(±S)

表11 瓜馥木總黃酮對小鼠懸尾行為的影響(±S)Table 11 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on the duration of immobility in tail suspension test(±S)

注:與對照組比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05，＊＊P＜0.01.

3.4.3 瓜馥木總黃酮對小鼠自主運動行為的影響

由表12 結(jié)果可見，各給藥組小鼠的自主運動情況與陽性對照和空白之間沒有顯著差異，提示抗抑郁劑量范圍內(nèi)的瓜馥木總黃酮沒有明顯的中樞興奮或抑制作用。

表12 瓜馥木總黃酮對小鼠自主運動行為的影響(±S)Table 12 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on movement distance of mice in the open-field test(±S)

表12 瓜馥木總黃酮對小鼠自主運動行為的影響(±S)Table 12 Effect of total flavonoids from F.oldhamii on movement distance of mice in the open-field test(±S)

4 討論與結(jié)論

本實驗在瓜馥木總黃酮部位純化工藝用樹脂的選擇上，對5 種大孔樹脂進行了對比選擇，其中以AB-8 型樹脂純化效果最為理想。瓜馥木總黃酮的最佳純化工藝為:藥材90%乙醇提取液，減壓回收溶劑至無醇味，殘留物加藥材10 倍量水超聲分散，離心，得濃度1.0 g 生藥材/mL 的上樣液，加至已處理好的AB-8 型大孔吸附樹脂床(徑高比1∶7)，吸附流速1.0 mL/min，待樹脂達(dá)到飽和吸附后，樹脂床用7 BV 5%乙醇除雜，再用8 BV 50%乙醇洗脫，洗脫流速1.0 mL/min，收集50%乙醇洗脫液，回收溶劑，減壓干燥，得瓜馥木總黃酮。經(jīng)純化后，產(chǎn)品中總黃酮的純度提高到57.3%。由此可見，AB-8 大孔吸附樹脂是瓜馥木總黃酮良好的純化劑，對瓜馥木總黃酮有較高的吸附和解吸性能，適用于總黃酮的純化研究。實驗方法操作簡單，所需成本低，能有效純化瓜馥木總黃酮，回收率高，為瓜馥木的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

本研究采用經(jīng)典抑郁動物模型小鼠懸尾、小鼠強迫游泳實驗評價瓜馥木總黃酮的抗抑郁活性。結(jié)果表明，陽性藥鹽酸氟西汀膠囊、瓜馥木總黃酮50 mg/kg 劑量給藥組均能明顯縮短小鼠強迫游泳和懸尾的不動時間，且各給藥組小鼠的自主運動情況與陽性對照和空白之間沒有顯著差異，提示瓜馥木總黃酮具有明確的抗抑郁作用。本實驗中瓜馥木中、高劑量組(100、150 mg/kg)抗抑郁藥效不明顯，可能是隨著給藥劑量增加，藥物作用靶點已經(jīng)達(dá)到飽和。目前有關(guān)瓜馥木總黃酮抗抑郁活性的機制研究還未見報道，本研究結(jié)果也為進一步研究黃酮類化合物的抗抑郁機制、以及發(fā)展新結(jié)構(gòu)及新作用的高效低毒抗抑郁劑提供了新的思路。

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