天山雪蓮不同器官中黃酮、總酚含量和抗氧化活性分析

白壯東，吳燕笛，韓乾奇，郭 斌，尉亞輝

西北大學(xué)生命科學(xué)院西部資源與現(xiàn)代生物技術(shù)省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室陜西省生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710069

菊科天山雪蓮Saussurea involucrata Kar.et Kir.，又名新疆雪蓮，高山雪蓮，藏語稱恰果蘇巴，維吾爾語稱喀爾古麗，生于新疆天山、阿爾泰山、昆侖山雪線附近的巖縫、石壁和冰磺礫石灘中，多年生一次性開花草本，為珍貴的高原藥用植物［1-3］。天山雪蓮含有黃酮類、生物堿、酚類、揮發(fā)油、鞣質(zhì)、木脂素類、多糖類等活性成分，在抗氧化、清除自由基、抗炎消腫、降低血壓血脂、抑制癌細(xì)胞增殖等方面有重要的作用［4-6］。另外，天山雪蓮中多糖和黃酮類物質(zhì)可抵抗疲勞，提高小鼠游泳的時間，減少小鼠血乳酸含量，增加肝糖原含量［7］。我們基于其抗氧化活性這一特點(diǎn)，對其不同部位(根、莖、葉、花苞片、花)的黃酮和總酚含量進(jìn)行測定，將其含量和抗氧化能力(還原力和DPPH 自由基清除率)指標(biāo)相結(jié)合，分析黃酮和總酚含量與雪蓮抗氧化活性之間的關(guān)系，為更好的利用和挖掘這一重要的高原藥用植物資源提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料:天山雪蓮，采自新疆天山天池附近，由西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院魏朔南教授鑒定為菊科植物天山雪蓮(與中科院植物所標(biāo)本館天山雪蓮標(biāo)本對比)，同株植物分為根、莖、葉、花苞片、花五部分。

試劑:1，1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、福林酚試劑 美國Sigma 公司;甲醇、乙醇、亞硝酸鈉、氯化鋁、氫氧化鈉、碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵均為國產(chǎn)分析純;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號100080-200707，裝量100 mg，供含量測定用);原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號110809-200604，裝量50 mg，供含量測定用)。

儀器:紫外分光光度計(jì)(島津UV-2501PC)、離心機(jī)(德國Eppendorf)、KQ5200DB 型數(shù)控超聲清洗器(中國玉環(huán)曙峰)、40 目篩子、研缽。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備

取天山雪蓮的根、莖、葉、花苞片、花，經(jīng)烘箱60℃干燥12 h，在研缽中研碎，過40 目篩。精確稱取10.0 g 于250 mL 的小燒杯中，加入80%乙醇100 mL，稱重，超聲處理1 h，放冷至室溫，再用80%乙醇補(bǔ)足減失的重量，離心分離，取上清液，過濾，濃縮，冷凍干燥得到不同部位提取物。用80%乙醇將提取物配制成10 mg/mL 的溶液，置于-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 總黃酮含量的測定

參考付婉藝等的方法［8］，并加以改進(jìn)。精確稱取10.0 mg 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，用80%的乙醇溶液在50 mL 容量瓶中配置成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。吸取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL 的標(biāo)準(zhǔn)液，分別于10 mL 的容量瓶中，加乙醇1 mL，搖勻，加5% NaNO20.15 mL，搖勻，放置6 min，加入10%AlCl30.15 mL 搖勻，放置6 min，加4% NaOH 2 mL搖勻，乙醇定容，放10 min 后于510 nm 處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得曲線方程(y=7.9200x+0.0453，R2=0.9969)。

分別吸取天山雪蓮根、莖、葉、花苞片、花提取液0.5 mL 進(jìn)行樣品測定，按照曲線方程獲得總黃酮的含量。提取物中總黃酮的含量表示為每克提取物相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)。

1.2.3 總酚含量測定［9］

精確稱取10.0 mg 原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容，配制成0.1 mg/mL 的原兒茶酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7 支25 mL 具塞刻度試管，分別移取0、0.2、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 標(biāo)準(zhǔn)溶液于試管中，加入1 mL 福林酚顯色劑，再依次給每個試管中加入5 mL 1 mol/L 的碳酸鈉水溶液，加入蒸餾水至10 mL，充分混合，在室溫、避光的條件下放置1 h，然后在波長760 nm 處測定吸光度。以原兒茶酸溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得曲線方程(y=162.31x+0.0935，R2=0.9963)。

吸取天山雪蓮根、莖、葉、花、花苞片提取液0.8 mL 進(jìn)行樣品測定，按照曲線方程獲得總酚的含量。提取物中總酚的含量表示為每克提取物相當(dāng)于原兒茶酸的毫克數(shù)。

1.2.4 還原能力的測定［10］

取七個相同規(guī)格的試管，編號1-7，1 號試管加入0.2 mL 80%乙醇作為空白樣品，2 號試管加入0.2 mL 濃度為2 mg/mL 的Vc 溶液作為對照樣品。其余3～6 號試管分別加入0.2 mL 天山雪蓮根、莖、葉、花苞片、花提取液作為樣品，依次給7 個試管加入磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)2.3 mL，再加入5 mL 1%鐵氰化鉀水溶液，放置在50 ℃水浴中反應(yīng)20 min，加入5 mL 10%三氯乙酸水溶液，混合均勻。分別在每個試管吸取上清液2.5 mL，置于新的對應(yīng)編號的試管中，然后依次加入2.5 mL 蒸餾水，0.5 mL 0.1%三氯化鐵水溶液，靜置5 min。在波長700 nm 處測吸光度。

1.2.5 自由基清除實(shí)驗(yàn)［11］

精確稱取4.0 mg DPPH(1，1-二苯基-2-苦肼基)，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇配置成0.04 mg/mL DPPH 溶液，分別吸取天山雪蓮根、莖、葉、花苞片、花提取液0.2 mL，置于5 個相同試管中，依次加入DPPH 甲醇溶液5 mL，放置在室溫下避光反應(yīng)1 h，在波長517 nm 處測吸光度A樣品，同時測定0.2 mL 甲醇在5 mL 0.04 mg/mL DPPH 甲醇溶液中的吸光度A空白。DPPH 的清除率計(jì)算方式:

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)用SAS9.2 軟件統(tǒng)計(jì)，顯著性分析采用方差分析和多重比較，利用Excel 表格進(jìn)行相關(guān)系數(shù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同部位提取物總酚、總黃酮含量

由表1 和表2 可知，天山雪蓮不同部位總酚和總黃酮的含量有顯著的差異(P＜0.05)?？傸S酮和總酚含量均以葉中的含量最多，分別為56.1 mg/g和10.5 mg/g。其次為花苞片(花)和根。莖中的總黃酮和總酚含量最少?？傸S酮和總酚的含量在花苞片和花中沒有顯著差異。從數(shù)據(jù)也可以看出，雪蓮中黃酮的含量高于總酚的含量。

表1 天山雪蓮不同部位提取物總黃酮含量(n=3，±s)Table 1 The content of flavonoids in different organs of S.involucrata(n=3，±s)

表1 天山雪蓮不同部位提取物總黃酮含量(n=3，±s)Table 1 The content of flavonoids in different organs of S.involucrata(n=3，±s)

注:同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P＜0.05)，下表同。Note:Values with different small letter in the same column indicated significant difference(P＜0.05)，same as below.

表2 天山雪蓮不同部位提取物總酚含量(n=3，±s)Table 2 The content of total phenolics in different organs of S.involucrata(n=3，±s)

表2 天山雪蓮不同部位提取物總酚含量(n=3，±s)Table 2 The content of total phenolics in different organs of S.involucrata(n=3，±s)

天山雪蓮中黃酮的含量已有很多人報(bào)道［12］，但是不同部位的含量對比沒有詳細(xì)的資料。我們對天山雪蓮不同部位的總黃酮含量進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)葉片中最高。因此，我們在采集雪蓮時，只需要將其葉片采摘，而不必要將其全株采挖。這樣既保護(hù)了野生雪蓮資源，又不影響對其有效成分的利用。酚類物質(zhì)也是藥用植物的有效成分之一［13］。本研究第一次報(bào)道了天山雪蓮總酚的含量，為天山雪蓮酚類物質(zhì)的研究提供數(shù)據(jù)參考。

2.2 不同部位提取物對Fe3+還原能力的影響

對Fe3+還原能力的測定是用來考察抗氧化劑還原能力的一種方法，在700 nm 處的吸收值越高，表示還原能力越強(qiáng)［14］。由表3 可知，天山雪蓮不同部位提取物對Fe3+還原能力不同，葉的還原能力顯著高于其他部位(P＜0.05)，對Fe3+還原能力大小次序是:葉片＞花苞片＞花＞根＞莖。通過不同部位提取物對Fe3+還原能力與其總酚、總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)比較，可得:莖、根、花、花苞片、葉提取物對Fe3+還原能力與總酚的相關(guān)系數(shù)r=0.9579，根據(jù)相關(guān)系數(shù)的t 檢驗(yàn)，二者顯著正相關(guān)(P＜0.05);與總黃酮的相關(guān)系數(shù)r=0.9902，根據(jù)相關(guān)系數(shù)的t 檢驗(yàn)，二者顯著正相關(guān)(P＜0.05)。相關(guān)性分析表明天山雪蓮不同部位提取物對Fe3+還原能力既與其總酚含量有關(guān)，又與其總黃酮含量有關(guān)。一直以來人們認(rèn)為天山雪蓮具有抗氧化活性［15］，主要因?yàn)槠渲泻悬S酮［12］。我們研究表明，天山雪蓮的抗氧化活性可能與其中的酚類物質(zhì)有密切的關(guān)系。

表3 不同部位提取物還原能力(n=3，±s)Table 3 Fe3+ reducing ability of different organs of S.involucrata(n=3，±s)

表3 不同部位提取物還原能力(n=3，±s)Table 3 Fe3+ reducing ability of different organs of S.involucrata(n=3，±s)

2.3 不同部位提取物對DPPH 自由基的清除作用

DPPH 是一種很穩(wěn)定的氮中心的自由基，自由基有單電子，在517 nm 處有一強(qiáng)吸收，其醇溶液呈現(xiàn)紫色的特征。DPPH 檢測法是通過DPPH 分子中一個穩(wěn)定的自由基與抗氧化劑提供的一個電子配對結(jié)合，使DPPH 的紫色逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系［16］。由表4 可知，天山雪蓮葉片提取物和花苞片提取物對DPPH 自由基的清除能力最強(qiáng)，顯著高于其他三個部位(P＜0.05);花和莖提取物對DPPH 自由基的清除能力最弱，顯著低于其他三個部位(P＜0.05)。通過不同部位提取物對DPPH 自由基的清除能力與其總酚、總黃酮含量的相關(guān)系數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)不同部位提取物對DPPH自由基清除能力與總酚的相關(guān)系數(shù)r=0.6678，根據(jù)相關(guān)系數(shù)的t 檢驗(yàn)，二者沒有顯著的直線相關(guān)關(guān)系;不同部位提取物對DPPH 自由基清除能力與總黃酮的相關(guān)系數(shù)r=0.7395，同樣進(jìn)行t 檢驗(yàn)，二者也沒有顯著的直線相關(guān)關(guān)系。另外，花提取物對DPPH自由基的清除率是13.32%，花苞片提取物對DPPH自由基的清除率是84.24%，差異顯著(P＜0.05)。從總酚和總黃酮含量來分析，花和花苞片中總酚和總黃酮含量沒有顯著性差異，而顯著低于葉片中的。這表明，花苞片中含有黃酮和酚類之外的抗氧化物質(zhì)，而這些物質(zhì)的存在導(dǎo)致其對DPPH 自由基的清除率的增加。這一結(jié)論為天山雪蓮中抗氧化物質(zhì)的分離提供依據(jù)。

表4 不同部位提取物對DPPH 自由基的清除能力(n=3，±s)Table 4 DPPH radical scavenging capacity of different organs of S.involucrata(n=3，±s)

表4 不同部位提取物對DPPH 自由基的清除能力(n=3，±s)Table 4 DPPH radical scavenging capacity of different organs of S.involucrata(n=3，±s)

3 結(jié)論

本研究測定了天山雪蓮根、莖、葉、花苞片和花中總黃酮和總酚含量，并對其提取物進(jìn)行了抗氧化分析(Fe3+還原能力和DPPH 自由基清除率)，得出葉中總黃酮和總酚含量最高，對Fe3+還原能力最強(qiáng)和DPPH 自由基清除能力最強(qiáng);花苞片總黃酮和總酚含量顯著低于葉(P＜0.05)，但DPPH 自由基清除能力與葉中的無顯著性差異。研究結(jié)果表明天山雪蓮葉片是抗氧化物含量最高的部位，可以作為雪蓮采摘和藥用的主要部位;另外，盡管天山雪蓮的花苞片生物量少，但其含有黃酮和酚類之外的抗氧化物質(zhì)，可以作為研究天山雪蓮抗氧化活性成分的材料來源。

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