石花菜醇提物對小鼠高尿酸血癥的拮抗效應(yīng)

肖 為，陶葉杏，谷毅鵬，陳秋揚，貝澤祈，張大艷，劉華忠

1 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院;2 廣東海洋大學(xué)理學(xué)院，湛江 524088

尿酸是體內(nèi)嘌呤代謝的最終產(chǎn)物，當(dāng)代謝過程發(fā)生紊亂時便有可能引發(fā)高尿酸血癥［1］。高尿酸可誘發(fā)多種疾病，如痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性腎病、尿酸結(jié)石甚至尿毒癥［2］等。目前，用于治療高尿酸血癥的化學(xué)藥品主要包括黃嘿呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇和促尿酸排泄藥物丙磺舒、苯溴馬?。?，4］等，不僅種類有限且對機(jī)體毒副作用較大。目前報道能夠降低血清中尿酸的天然藥物主要有茶樹根、芒果苷、迷迭香、秦皮等［5-8］，而石花菜醇提物的降尿酸功效筆者尚未見文獻(xiàn)報道。

石花菜(Gelidium amansii)別名雞毛菜、草珊瑚、海冬菜等，屬于紅藻門石花菜科。為中國黃海、渤海、東海常見種類，供食用，也是提取瓊膠的主要原料［9］。瓊膠的用途十分廣泛，主要可作為微生物培養(yǎng)基，用于水產(chǎn)、醫(yī)藥、釀造以及很多生物學(xué)部門研究開發(fā)［10］。孫杰［11］等對石花菜醇提取物的化學(xué)成分檢測分析發(fā)現(xiàn)其含有多種活性成分，如糖類、生物堿等，均具有一定的生理和藥理活性。本文主要研究不同劑量石花菜醇提物對氧嗪酸鉀鹽誘導(dǎo)小鼠高尿酸血癥的拮抗作用，為進(jìn)一步開發(fā)和利用石花菜防治高尿酸血癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF 級性成熟的昆明雄性小鼠，生產(chǎn)許可證號:SCXK 桂2009-0002，8 周齡共60 只(24.11±3.05 g)，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心;石花菜(經(jīng)廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院謝恩義教授鑒定)采自廣東湛江硇洲島。

尿酸(UA)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、黃嘌呤氧化酶(XOD)、腺苷脫氨酶(ADA)、考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒(貨號依次為:C012、C011-1、C013-1、A002、A048、A045-2)，南京建成生物工程研究所;別嘌呤醇，美國Sigma-Aldrich 公司;羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;氧嗪酸鉀鹽，Aidrieh Chemical Company，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器

MP200A 型電子天平，上海精科天平;GZX-9140 MBE 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司SHZ-DⅢ真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;90-1 型臺式低速離心機(jī)，上海手術(shù)器械廠;7200 型分光光度計，尤尼柯上海儀器有限公司;BX51 型多功能顯微鏡;UC7 型超薄切片機(jī)，德國萊卡。

1.3 方法

1.3.1 石花菜醇提物制備［12］

新鮮石花菜樣品采集后，除去附生生物，淡水沖凈后冷凍保存。用前取出解凍，濾紙拭干藻體。取干燥藻體稱量后用剪刀剪碎。將石花菜按1∶14 的料液比加入50%的乙醇溶液浸泡，在室溫下放置3 d，最后抽濾即得石花菜醇提物。

1.3.2 實驗動物分組與處理

將60 只小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為6 組，即空白組(A)、模型組(B)、陽性對照組(C)、治療組1(D)、治療組2(E)、治療組3(F)，每組10 只。將別嘌呤醇混懸于濃度0.8% CMC-Na 中，陽性對照組灌胃該混懸液劑量為40 mg/(kg·d)［13］。通過前期灌胃不同劑量石花菜醇提物的預(yù)實驗分析可知，3 個治療組可分別設(shè)置灌胃石花菜醇提物劑量為低劑量0.3 mg/(kg·d)、中劑量0.6 mg/(kg·d)、高劑量1.0 mg/(kg·d)。嚴(yán)格控制飼養(yǎng)環(huán)境(溫度22±2 ℃，濕度55±5%，光照12 h)自由攝入水和飼料。各組實驗動物均連續(xù)處理8 d，正常給水、喂食及飼養(yǎng)。

1.3.3 高尿酸血癥小鼠模型的建立［14］

采用氧嗪酸鉀鹽抑制尿酸分解的方法建立小鼠高尿酸模型。氧嗪酸鉀鹽用滅菌蒸餾水配制成混懸液(250 mg/kg)，每天在正常給藥前1 h，除正常組灌胃一定量生理鹽水，其余各組分別灌胃等量氧嗪酸鉀鹽混懸液。藥物治療組在開始灌胃氧嗪酸鉀鹽時，每天對相應(yīng)組別小鼠進(jìn)行治療藥物灌胃，實驗分組及藥物處理如表1 所示。

表1 實驗動物分組及藥物處理Table 1 The grouping and drug treatment of the experimental animals

1.3.4 病理學(xué)觀察

藥物處理8 d 后，脫頸椎處死小鼠，取小鼠腎臟，用預(yù)冷生理鹽水進(jìn)行清洗并稱重，然后將一側(cè)腎臟于10%中性甲醛溶液中固定24 h，脫水石蠟包埋，以4～5 μm 厚度連續(xù)切片，置于干凈載玻片后，用蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察病理變化。

1.3.5 血清尿酸(UA)水平測定

藥物處理8 d 后，摘取眼球取血，采用磷鎢酸法測定血清尿酸水平。無蛋白濾液中尿酸在堿性狀態(tài)下還原磷鎢酸生成鎢藍(lán)、尿囊素和二氧化碳，藍(lán)色深淺與尿酸濃度成正比。檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.6 血清肌酐(Cr)水平測定

藥物處理8 d 后，摘取眼球取血，利用除蛋白的血清中肌酐與苦味酸產(chǎn)生Jaffe 反應(yīng)生成桔紅色加成物進(jìn)行測定。檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.7 血清尿素氮(BUN)水平測定

藥物處理8 d 后，摘取眼球取血，尿素氮水解生成NH3和CO2，其中NH3與指示劑發(fā)生反應(yīng)引起顏色變化，利用分光光度法檢測可得。檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.8 肝臟黃嘌呤氧化酶(XOD)活性測定

藥物處理8 d 后，脫頸椎處死小鼠，取小鼠肝臟制勻漿液，肝臟中的XOD 可催化次黃嘌呤生成黃嘌呤，且產(chǎn)生超氧陰離子自由基，在顯色劑和電子受體同時存在時，可生成紅紫色結(jié)合物，根據(jù)生成量多少檢測XOD 活力。檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.9 肝臟腺苷脫氨酶(ADA)活性測定

藥物處理8 d 后，脫頸椎處死小鼠，取小鼠肝臟制勻漿液，肝臟中的ADA 可催化腺嘌呤核苷水解，產(chǎn)生次黃嘌呤核苷和氨，再對產(chǎn)生的氨顯色，便可根據(jù)OD 值計算ADA 活性。檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3.10 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對所有試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。不同處理間差異，采用t 檢驗和單因素方差分析進(jìn)行比較，以P＜0.05 為具有顯著性。結(jié)果用“x±S”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 病理學(xué)觀察

由圖1 腎臟病理學(xué)圖片分析可知，正常組中腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎間質(zhì)含量豐富，腎小球數(shù)量較多，且相互間隔較均勻，大小正常。模型組中腎小球萎縮變形，數(shù)目明顯較正常組減少。陽性對照組及各石花菜醇提物治療組腎小球的結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常、數(shù)目也較模型組明顯增多，腎小球萎縮現(xiàn)象有一定程度緩解，尤其是陽性對照組C 及治療組F，腎小球數(shù)目較模型組增多較為顯著。

2.2 血清尿酸水平比較

一般認(rèn)為血清尿酸≥70.58 g/L(416 μmol/L)時為高尿酸血癥［13］，比較可知模型組血尿酸含量大于此高尿酸血癥最低值造模成功。由表2 可知，與空白組相比，模型組小鼠尿酸水平顯著升高(P＜0.01)，陽性對照組與治療組F 均無統(tǒng)計學(xué)差異。與模型組相比，陽性對照組和各藥物治療組小鼠血清尿酸水平均顯著降低(P＜0.01)。說明石花菜醇提物能明顯降低血清尿酸水平，其中治療組F 效果較其他藥物組尤其明顯，并與空白組指標(biāo)最為接近。

圖1 石花菜醇提取物對腎臟組織病理學(xué)變化的影響Fig.1 Effect of G.amansii alcohol extract on kidney tissue pathological change

表2 石花菜醇提取物對小鼠血清尿酸水平的影響Table 2 Effect of G.amansii alcohol extract on serum uric acid levels in mouse

2.3 血清肌酐與尿素氮水平比較

表3 石花菜醇提取物對小鼠血清肌酐、尿素氮水平的影響Table 3 Effect of G.amansii alcohol extract on Cr and BUN level in mouse

由表3 可知，與空白組相比，模型組小鼠肌酐與尿素氮水平均顯著升高(P＜0.01)，治療組E 的肌酐水平升高，其他各組小鼠的肌酐與尿素氮水平均無統(tǒng)計學(xué)差異。與模型組相比，陽性對照組與各藥物治療組在小鼠肌酐與尿素氮水平上均顯著降低(P＜0.01)，其中，肌酐與尿素氮水平均為治療組F與空白組最為接近。說明，石花菜醇提物能顯著的降低高尿酸血癥小鼠血清中肌酐與尿素氮水平，其中，均為治療組F 效果較其他藥物組尤為顯著。

2.4 肝臟XOD 及ADA 活性比較

表4 石花菜醇提取物對小鼠肝臟XOD 及ADA 活性的影響Table 4 Effect of G.amansii alcohol extract on the XOD and ADA activities in mouse liver

由表4 可知，與空白組相比，模型組小鼠肝臟ADA 的活性升高(P＜0.05)，且XOD 活性顯著升高(P＜0.01)，而陽性對照組和各藥物治療組小鼠的肝臟中ADA 與XOD 活性均無統(tǒng)計學(xué)差異。與模型組相比，陽性對照組與各藥物治療組小鼠肝臟XOD活性顯著降低(P＜0.01)，而ADA 活性無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)果表明，石花菜醇提物能一定程度上恢復(fù)氧嗪酸鉀鹽致小鼠肝臟XOD 水平的異常。

3 討論

現(xiàn)在普遍認(rèn)為，高尿酸血癥與代謝綜合征有十分緊密的聯(lián)系，而臨床藥物治療高尿酸血癥主要采取促尿酸代謝和抑制尿酸在體內(nèi)生成為主。目前，促尿酸排泄的藥物苯溴馬隆和抑制體內(nèi)尿酸合成的別嘌呤醇，均存在一定的不良反應(yīng)，如造血功能異常、肝腎功能障礙、痛風(fēng)發(fā)作等使它們在臨床應(yīng)用上受到一定限制［15］。所以探索具有促進(jìn)體內(nèi)尿酸排泄和抑制體內(nèi)尿酸合成雙重作用的天然藥物對于治療高尿酸血癥有重要意義。古代醫(yī)藥典籍記載，石花菜味甘咸，性寒，全藻入藥能消熱解毒、緩瀉，有利便利尿之功效，可用于治療腎盂、腎炎等癥狀?，F(xiàn)代研究表明，石花菜所含的褐藻酸鹽類物質(zhì)有一定的降血壓作用，所含多糖類物質(zhì)淀粉類硫酸脂具有降脂功能，對高血壓、高血脂也有一定的防治作用［16］?；诖?，本實驗首次選用石花菜為研究對象，對其醇提物對高尿酸血癥小鼠的拮抗效應(yīng)進(jìn)行研究。

根據(jù)本實驗結(jié)果分析可知，與模型組相比，各藥物組小鼠血清中尿酸(UA)、肌酐(Cr)和尿素氮(BUN)水平均極顯著降低(P＜0.01)，且以1.0 g/kg 的藥物組F 效果尤為明顯，同時，肌酐和尿素氮水平也是間接反應(yīng)腎功能的重要指標(biāo)［17］，表明石花菜醇提物可一定程度上保護(hù)腎功能，對于促進(jìn)尿酸在體內(nèi)的代謝有十分積極的作用。

肝臟中的XOD、ADA 均為體內(nèi)尿酸合成中的關(guān)鍵性酶，在尿酸合成過程中發(fā)揮極其重要的作用，當(dāng)肝臟中的XOD、ADA 活性升高時，可促進(jìn)體內(nèi)核酸分解代謝，其可將次黃嘌呤、黃嘌呤氧化生成尿酸，從而影響尿酸水平使其升高［18］，目前，XOD、ADA作為尿酸生成的關(guān)鍵酶，其抑制劑的研究是抗高尿酸血癥和痛風(fēng)藥物開發(fā)的重點。由本實驗分析可知，與模型組相比，各藥物治療組雖然對于小鼠肝臟ADA 活性無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，但石花菜醇提物能一定程度上緩解氧嗪酸鉀鹽致小鼠肝臟XOD水平的異常，對XOD 活性可顯著降低(P＜0.01)。說明石花菜醇提物對于抑制尿酸在體內(nèi)的合成有一定的積極意義。

本文研究結(jié)果表明，石花菜醇提物能明顯降低模型小鼠血清中的尿酸、肌酐與尿素氮水平，并且可以通過抑制肝臟內(nèi)XOD 的活性，緩解高尿酸所致的肝、腎功能損傷，且綜合實驗數(shù)據(jù)以1.0 g/kg 的石花菜醇提物的效果最佳。石花菜醇提物對小鼠高尿酸血癥的治療作用主要通過降低血清中尿酸、肌酐和尿素氮水平促進(jìn)排泄，且可降低肝臟中XOD 活性，一定程度上抑制尿酸在體內(nèi)的合成，但其具體機(jī)制尚不清楚。

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