粉碎程度對杏鮑菇下腳料粗多糖理化性質(zhì)和巨噬細胞活性的影響

薛令坤，唐慶九，劉艷芳*，周 帥，楊 焱，吳 迪，于華崢，3，張勁松*

1 國家食用菌工程技術(shù)研究中心 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點實驗室 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，上海 201403;2 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306;3上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234

杏鮑菇(Pleurotus eryngii)，又名刺芹側(cè)耳，隸屬于傘菌目側(cè)耳科。它口味鮮美，富含多糖、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等多種營養(yǎng)成分，是近年來開發(fā)的集食用和藥用于一體的新型真菌［1］。多糖是其主要活性成分之一，因具有抗腫瘤［2］、降血脂［3］、潤腸胃［4］等多種活性而備受關(guān)注。目前關(guān)于杏鮑菇子實體和菌絲體多糖提取工藝的報道較多［5，6］，對于杏鮑菇菇腳、菇片等下腳料提取的研究較少。據(jù)報道，杏鮑菇下腳料與其子實體營養(yǎng)成分相近，下腳料中也含有大量的多糖［7］，因此以下腳料為原料進行多糖提取，可以有效降低成本。

近年來，為提高天然產(chǎn)物活性成分的提取得率，超細粉碎技術(shù)已在中藥加工制劑過程中有較多應(yīng)用。研究認為，物料經(jīng)超細粉碎后細胞壁大部分被破壞，從而增加了有效成分的提取率［8］?，F(xiàn)如今，該工藝在食用菌有效成分提取尤其是多糖提取工藝研究中也多有應(yīng)用。但超細粉碎技術(shù)對杏鮑菇下腳料粗多糖提取及多糖理化性質(zhì)的影響未見報道。本研究選取杏鮑菇下腳料為材料，采用常規(guī)粉碎和超細粉碎對其進行處理，比較粉碎程度對粗多糖提取得率、理化性質(zhì)和生物活性產(chǎn)生的影響，以期為杏鮑菇多糖的進一步研究與利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇下腳料碎塊(約1×3×0.5 cm)由上海國森生物科技有限公司提供，于60 ℃烘干至恒重后置于干燥器備用。DMEM 高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640、胎牛血清(FBS)、胰酶為GIBCO 公司產(chǎn)品，三氟乙酸(TFA)、細菌脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)為Sigma 公司產(chǎn)品，其他為國產(chǎn)分析純試劑，RAW 264.7 細胞株購自中科院細胞所。

1.2 儀器與設(shè)備

中藥粉碎機DJ-10A(上海淀久公司)，超微粉碎震動磨機BFM100B(濟南倍力粉公司)，光學(xué)顯微鏡(Olympus IX71)，激光粒度儀(微米級，Malvern Mastersizer 2000)，臺式高速大容量離心機(Eppendorf公司)，Synergy HT 多功能酶標儀(Bio-Tek 公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo Forma 公司)，細胞計數(shù)儀(Beckman Coulter 公司)，ICS-2500 型高效離子色譜儀(Dionex 公司)，脈沖安培檢測器(Dionex 公司)，HPSEC-MALLS-RI 聯(lián)用系統(tǒng)由Waters 2695 HPLC泵，氦-氖激光光源的八角度激光光散射檢測器(MALLS，Wyatt 公 司)、ViscosStar Ⅱ粘 度 檢 測 器(Wyatt 公司)和Waters 2414 示差檢測器(RI)組成。

1.3 方法

1.3.1 杏鮑菇下腳料細粉與超細粉末的制備

用中藥粉碎機在常溫下將杏鮑菇下腳料碎塊粉碎1 min 左右，過80 目篩，收集粉末為細粉;用超微粉碎震動磨機-10 ℃下粉碎30 min，過200 目篩，收集粉末為超細粉末。

1.3.2 顯微觀察與粒徑分析

采用光學(xué)顯微鏡對杏鮑菇下腳料粉末進行顯微觀察，并通過激光粒度分析儀，根據(jù)GB/T 19077.1-2008 對其粒徑大小及分布進行測定。

1.3.3 粗多糖提取

取不同處理的杏鮑菇下腳料樣品10 g，料液比1∶20(g∶mL)，沸水浴提取2 h，提取液經(jīng)10000 rpm離心15 min，殘渣以相同方式再提取一次，合并兩次上清液，濃縮，加無水乙醇調(diào)至乙醇終濃度為70 %，靜置過夜，10000 rpm 離心15 min，沉淀加適量蒸餾水復(fù)溶，用截留分子量為3500 Da 透析袋對粗多糖溶液4 ℃透析3 d，去除小分子物質(zhì)，然后將透析好的粗多糖溶液冷凍干燥，得粗多糖干品。

分析天平稱量粗多糖干品的質(zhì)量，按以下公式計算粗多糖得率:

粗多糖得率(%)=粗多糖的質(zhì)量(g)/稱取樣品的質(zhì)量(g)×100%

1.3.3.1 粗多糖中水溶性多糖含量測定

精密稱取5 mg 粗多糖樣品，加蒸餾水充分溶解并定容至10 mL，離心，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量［9］。由于粗多糖在制備時經(jīng)過醇沉及透析去除小分子，故粗多糖中還原糖含量極低，可以忽略不計，用苯酚-硫酸法測得的總糖含量，即為多糖含量。

1.3.3.2 粗多糖中β-葡聚糖含量測定

精密稱取10 mg 粗多糖樣品，參照Megazyme 公司的酵母和蘑菇β-葡聚糖檢測試劑盒中的方法，對粗多糖中β-葡聚糖及α-葡聚糖含量進行測定。

1.3.4 HPSEC-MALLS-VS-RI 聯(lián)用［10］分析粗多糖分子量分布及多糖分子特性

稱取5 mg 粗多糖，加入1 mL 流動相，充分溶解，12000 rpm 離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm 水相過濾頭過濾后進行HPSEC-MALLS-VS-RI 分析。

色譜分析條件為:色譜柱為TSK PWXL6000 和TSK PWXL3000 凝膠色譜柱串聯(lián)，流動相為含0.05 mol/L 的NaH2PO4和0.15 mol/L 的NaNO3溶液(pH=7，0.02%疊氮鈉)，流速為0.5 mL/min，柱溫為35 ℃;檢測器采用多角度激光光散射檢測器(光源波長選用623.8 nm)、粘度檢測器、示差折光檢測器串聯(lián)使用，多糖在溶液中的折光指數(shù)增量(dn/dc)按照0.146 mL/g 計算。

使用Astra(version 6.1.1，Wyatt Technology，Santa Barbara，CA)數(shù)據(jù)分析軟件對光散射數(shù)據(jù)進行采集和分析，計算多糖分子量和其他分子特性。

1.3.5 單糖組成分析

稱取2 mg 粗多糖置于帶蓋玻璃瓶中，加入3 mL 2 mol/L 的三氟乙酸(TFA)，110 ℃油浴4 h，冷卻至室溫，50 ℃條件下氮氣吹干，再加甲醇吹干，重復(fù)以上操作3～4 次以完全除去TFA，用超純水溶解并轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶，定容，稀釋20 倍后上樣測定。

色譜條件:參照文獻［11］的方法進行。

1.3.6 粗多糖對巨噬細胞活性的影響

精密稱取透析后的粗多糖樣品5 mg，加入滅菌的eppendorf 管中，用無菌的PBS 配制成5 mg/mL的濃度，充分溶解，13200 rpm 離心30 min 除菌，無菌條件下，用移液槍將離心上清液轉(zhuǎn)移至新的無菌eppendorf 管中，然后取一定量稀釋成2 mg/mL、0.5 mg/mL 的濃度備用，并以10 μg/mL LPS 為陽性對照，以PBS 為陰性對照，按文獻［12］的方法測定巨噬細胞釋放NO 的產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微形態(tài)觀察與粉體粒徑分布比較從圖1 顯微形態(tài)觀察結(jié)果可知，杏鮑菇下腳料細粉(圖1A)在顯微鏡下觀察可見菌絲體片段和較大組織碎片，且顆粒大小不均勻，存在少許細小顆粒;而超細粉末(圖1B)在整個視野遍布細小的顆粒，有少許小的組織片段，但沒有明顯的塊狀物。

杏鮑菇下腳料細粉粒徑分布圖(圖2A)分析結(jié)果顯示，其粒度范圍(D50-D90)在48.828～210.617μm，分布不對稱，其體積平均粒徑為83.548 μm，均勻性差;而超細粉末(圖2B)D50-D90 為13.548～36.954 μm，分布范圍較窄，粒度分布為成正態(tài)分布的單峰，體積平均粒徑為17.553 μm，均勻性好。與細粉相比，超細粉體積平均粒徑降低了65.995 μm。

2.2 粗多糖得率及多糖和葡聚糖含量測定結(jié)果比較

由表1 結(jié)果可知，隨著杏鮑菇下腳料粉碎程度的增大，粗多糖得率和粗多糖中多糖含量均有明顯的增加，超細粉末提取得率和多糖含量均為最高，分別為11.52%和56.97%，是碎塊提取多糖得率和多糖含量的4.14 倍和1.37 倍。說明粉碎程度的增加，有利于多糖的溶出和釋放提?。?3］。

圖1 杏鮑菇下腳料細粉(A)和超細粉末(B)的顯微形態(tài)(10×40)Fig.1 Microscopic configuration of fine powder(A)and ultrafine powder(B)of P.eryngii leftover

圖2 細粉(A)和超細粉末(B)的粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of fine powder(A)and ultrafine powder(B)

同時，隨著粉碎程度的增加，粗多糖中β-葡聚糖含量明顯增加，且β-葡聚糖含量占粗多糖含量的比例也在增大，超細粉末提取所得粗多糖中，β-葡聚糖含量為23.61%、占粗多糖的41.44%。另外，與碎塊相比，粉末提取所得粗多糖中的α-葡聚糖含量也明顯增加，這可能與杏鮑菇下腳料的細胞壁組成有關(guān)［14］。

表1 粉碎程度對粗多糖得率、多糖含量和葡聚糖含量的影響Table 1 Effect of different size powders on yields，polysaccharide content and glucan content of crude polysaccharides

2.3 粗多糖分子量分布及特征分析

不同粉碎程度所得杏鮑菇下腳料粗多糖的HPSEC-MALLS-VS-RI 分析圖譜(圖3)顯示，三種粗多糖均主要含有3 個組分，且各樣品中相應(yīng)組分的保留時間基本接近，但經(jīng)粉碎后，組分1 和組分2 的峰面積明顯增加，組分3 的峰面積相對減小。各組分的分子量、多分散指數(shù)和特性粘度分析結(jié)果如表2 所示。其中組分1 與組分2 的重均分子量(Mw)均達到200 萬道爾頓以上，為高分子量部分，且細粉組分1 與2 的重均分子量均高于碎塊和超細粉末;組分3 的分子量相對較低，在碎塊提取粗多糖中，該組分重均分子量約為6.35 萬道爾頓，經(jīng)過細粉和超微粉碎后，該部分的重均分子量明顯增大，達到20萬道爾頓以上?？偟膩碇v，粉碎后提取粗多糖中各組分的分子量大于碎塊中相應(yīng)組分的分子量，且高分子量部分所占比例增加。這說明粉碎處理有助于杏鮑菇下腳料中大分子多糖的釋放。

另外，由表2 數(shù)據(jù)還可以看出，與碎塊提取多糖相比，經(jīng)細粉后，組分2 和3 的多分散系數(shù)均降低，證明多糖的分子量分布范圍變窄。就高分子量組分而言，組分2 雖然重均分子量大于組分1，但其特性粘度(［η］)較小，其中組分1 的特性粘度為1300 mL/g 以上，而組分2 的僅為100～186 mL/g 之間。特性粘度為多糖的特征參數(shù)，與其結(jié)構(gòu)和構(gòu)象有關(guān)，說明組分1 和2 的結(jié)構(gòu)特征差異明顯。

圖3 不同粉碎程度所得粗多糖的液相分析圖譜Fig.3 HPSEC chromatograms of crude polysaccharides extracted from different size powders

表2 不同粉碎程度所得粗多糖分子量分布范圍Table 2 Molecular weight distribution of crude polysaccharides extracted from different size powders

2.4 粗多糖單糖組成分析

各粗多糖水解后，經(jīng)高效陰離子色譜(HPAEC)檢測所得單糖組成及其摩爾百分比結(jié)果如表3 和圖4 所示。三種粉碎方式所得粗多糖的單糖組成種類相同，都含有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖五種單糖，但單糖組成摩爾比存在明顯差異(表3所示)。與碎塊所得粗多糖相比，粉碎后所得粗多糖中葡萄糖所占比例大大增加，表現(xiàn)為超細粉末葡萄糖摩爾百分比最高，為75.58%，是碎塊提取多糖葡萄糖摩爾百分比的2.5 倍，說明粉碎處理促進了葡聚糖類多糖的釋放，這也和表1 中細粉、超細粉末的葡聚糖含量較高相吻合。

表3 不同粉碎程度所得粗多糖的單糖組成摩爾百分比Table 3 Molar ratio of monosaccharide of crude polysaccharides of different size powders

圖4 不同粉碎程度所得粗多糖的單糖組成Fig.4 Monosaccharide compositions of crude polysaccharides extracted from different size powders

2.5 粗多糖激活RAW264.7 細胞釋放NO 活性的比較

不同粉碎程度所得粗多糖體外活性測試結(jié)果如圖5 所示。結(jié)果顯示，碎塊、細粉和超細粉所得粗多糖均具有體外刺激巨噬細胞釋放NO 的活性，且隨著各樣品濃度的增加，其刺激巨噬細胞釋放NO 的量也有所增加，呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性?？偟膩砜?，細粉和超細粉提取所得粗多糖活性略好于碎塊，這可能與其多糖的含量及種類相關(guān)，需要進一步開展研究。

圖5 不同粉碎程度所得粗多糖對RAW264.7 細胞分泌NO 的影響Fig.5 Effects of polysaccharides extracted from different size powders on NO release from RAW264.7 cells

3 討論

本文分別以杏鮑菇下腳料碎塊、細粉和超細粉末為材料，分析比較了其提取所得粗多糖的理化性質(zhì)和生物活性的差異，發(fā)現(xiàn)與碎塊提取所得粗多糖相比，細粉、超細粉末所得粗多糖在多糖得率、多糖含量以及葡聚糖含量上都有顯著增加，且粉碎處理后，提取多糖中400～800 萬道爾頓大分子量多糖組分所占比例明顯增大，說明粉碎處理對細胞壁產(chǎn)生一定的破壞，從而促進細胞內(nèi)容物的釋放。據(jù)報道，真菌細胞壁多糖成分以葡聚糖為主［15］，經(jīng)過粉碎處理后，杏鮑菇下腳料的細胞壁遭到破壞，胞壁多糖大量釋放，使得葡聚糖含量及葡萄糖的摩爾百分比均增大。尤其是經(jīng)超細粉碎處理后，提取所得多糖的β-葡聚糖含量是碎塊的2.2 倍，葡萄糖摩爾百分比是碎塊的2.5 倍，因此，超細粉碎技術(shù)在杏鮑菇胞壁β-葡聚糖高效提取工藝方面將有很大的實用價值和應(yīng)用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)，超細粉末提取的杏鮑菇下腳料多糖具有比碎塊提取多糖更高的刺激巨噬細胞活性。文獻報道［16］，分子量大于3000 kDa 的灰樹花高分子量多糖具有更高的活性，而超微粉末多糖含有更多的高分子量組分，因而可以推測杏鮑菇多糖的活性部位可能為高分子量多糖。而多糖的分子量與其特性粘度有很大關(guān)聯(lián)性，一般來講分子量較大的多糖具有更高的特性粘度［17］，但杏鮑菇多糖的組分1與組分2 卻呈現(xiàn)相反的規(guī)律，這可能與兩組分具有不同的高級結(jié)構(gòu)相關(guān)。多糖的活性也受其高級結(jié)構(gòu)的影響，如香菇β-(1-3)-D-葡聚糖以三重螺旋的鏈構(gòu)象存在時具有抗腫瘤活性，當(dāng)其分解為單一螺旋時，抗腫瘤活性顯著下降或消失。因而有必要對杏鮑菇多糖組分1 與組分2 進行分離純化，進而探究杏鮑菇多糖高級結(jié)構(gòu)與其活性的關(guān)系。

1 Wang SX，Yin YG，Liu Y，et al.Evaluation of genetic diversity among Chinese Pleurotus eryngi cultivars by combined RAPD/ISSR marker.Current Micro-biology，2012，65:421-431.

2 Jung HY，Bae IY，Lee SY，et al.Effect of the degree of sulfation on the physicochemical and biological properties of Pleurotus eryngii polysaccharides.Food Hydrocolloid，2011，25:1291-1295.

3 Chen JJ，Mao D，Yong YY，et al.Hepatoprotective and hypolipidemic effects of water-soluble polysaccharidic extract of Pleurotus eryngii.Food Chem，2012，130:687-694.

4 Synytsya A，Micvkova K，Synytsya A，et al.Glucans from fruit bodies of cultivated mushrooms Pleurotus ostreatus and Pleurotus eryngii:Structure and potential prebiotic activity.Carbohyd Polym，2009，76:548-556.

5 Meng S(孟思)，Liu XY(劉曉宇)，Li XH(李信輝)，et al.Study on extraction of polysaccharides from Pleurotus eryngii.Food Sci(食品科學(xué))，2007，28:141-143.

6 Zhang ZJ(張志軍)，Li SF(李淑芳)，Huang C(黃超)，et al.Optimization of polysaccharide extraction from Pleurotus eryngii using ultrasound and the moisturizing effect of extrac-ted material.Acta Edul Fun(食用菌學(xué)報)，2010，17(2):76-79.

7 Zhang Q(張慶)，Lin K(林凱)，Yuan CH(袁春紅)，et al.Optimization of polysaccharide from the residue of Pleurotus eryngii using response surface methodology.J Xihua Univ:Nat Sci(西華大學(xué)學(xué)報，自科版)，2014，33(2):88-92.

8 Chen YH(陳宇紅).The effect of superfine grind process on dissolving of effective components of Radix Astragali.Ningxia Med J(寧夏醫(yī)學(xué)雜志)，2007，29:215-217.

9 Zhang WJ(張維杰).Sugar Complex Biochemical Research Technology.Zhejiang:Zhejiang University Press，1994.

10 Liu YF，Tang QJ，Zhang JS，et al.Structural characteristics and hypoglycemic activity of polysaccharides from Coprinus comatus.Bioactive Carbohydr Dietary Fibre，2013，2:164-169.

11 Yang Y，Zhang JS，Liu YF，et al.Structural elucidation of a 3-O-methyl-galactose-containing neutral polysaccharide from fruiting bodies of Phellinus igniarius.Carbohydr Res，2007，342:1063-1070.

12 Du XJ(杜秀菊).Purification，structural characterization，molecular modification and biological activities of polysaccharides from of Tremella aurantialba fruiting bodies.Nanjing:Nanjing Agricultural University(南京農(nóng)業(yè)大學(xué))，PhD.2009.

13 Yang XL(楊曉麗)，Li X(李翔)，Shen LR(沈立榮)，et al.Physicochemical properties of ultrafine Garnoderma lucidum powder.J Food Sci Biotechnol(食品與生物技術(shù)學(xué)報)，2013，32:69-74.

14 Klis FM，Ram AFJ，De Groot PWJ.A molecular and genomic view of the fungal cell wall.Biol Fungal Cell，2007，8:97-120.

15 Ruthes AC，Smiderle FR，Iacomini M.D-Glucans from edible mushrooms:A review on the extraction，puri?cation and chemical characterization approaches.Carbohydr Polymer，2014，117:753-761.

16 Zhou CY(周昌艷)，Wu AZ(吳愛忠)，Yan PL(嚴陪蘭)，et al.Isolation and purification of GFLP，a high-molecule polysaccharide from Grifola frondosa fruit bodies and its effect on immune cells.Acta Edul Fun(食用菌學(xué)報)，2013，20(4):39-42.

17 Wang ZM，Cheung YC，Leung PH，et al.Ultrasonic treatment for improved solution properties of a high-molecular weight exopolysaccharide produced by a medicinal fungus.Biores Technol，2010，10:5517-5522.