藏藥菥蓂中黑芥子苷對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸作用的研究

柯秀梅，楊榮平，王云紅，劉 楠，周文杰，張小梅*

1 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137;2 重慶市中藥研究院重慶市中藥資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400065

痛風(fēng)是由于嘌呤代謝紊亂，產(chǎn)生尿酸過多和(或)尿酸排泄減少，血尿酸濃度持續(xù)增高所致的一組疾病［1］，高尿酸血癥為其特征性表現(xiàn)之一。隨著人們生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，痛風(fēng)發(fā)病率已日益增加［2］。有調(diào)查結(jié)果表明，我國痛風(fēng)患者占總?cè)丝诘?%～2%［3］，有人預(yù)計(jì)21 世紀(jì)痛風(fēng)患者在我國將成為僅次于糖尿病的代謝?。?］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)痛風(fēng)的治療已取得較大進(jìn)展，但短期療效顯著，長期效果不理想，且副作用大。傳統(tǒng)醫(yī)藥獨(dú)特的辯證體系在治療、緩解本病病情方面具一定優(yōu)勢(shì)。

菥蓂為雙子葉植物十字花科菥蓂Thlaspi arvense L.的干燥地上部分，又叫遏藍(lán)菜、蘇敗醬(江蘇)、南敗醬(湖北)、苦芥子等，分布全國各地［5］，為藥食兩用的藏藥。其嫩苗、全草、種子皆可入藥，嫩苗和中益氣、利肝明目;全草具有清熱解毒、消腫排膿［6］的功效，主治目赤腫痛、淚出、脘腹脹痛，脅痛，腸癰，水腫，帶下，瘡癤癰腫，常用于治療腎炎、子宮內(nèi)膜炎［7］。在西藏民間常用來治療痛風(fēng)，效果甚好。菥蓂全草含有黑芥子苷、芥子酶、吲哚類［8］、揮發(fā)油［9］和黃酮類［10］等成分。文獻(xiàn)報(bào)道，黑芥子苷能促進(jìn)尿酸排泄，有效治療痛風(fēng)［11］。課題組前期將菥蓂用于治療痛風(fēng)并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究，在此基礎(chǔ)上，本文研究提取液中黑芥子苷的含量與其降低黃嘌呤致小鼠高尿酸模型尿酸程度作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器

藥材購于重慶儲(chǔ)奇門藥材市場(chǎng)，經(jīng)重慶市中藥研究院生藥所秦松云副研究員鑒定為十字花科菥蓂植物的干燥地上部位;別嘌醇片(重慶青陽藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)為110301);黃嘌呤(美國SIGMA公司，批號(hào)為20100613);黑芥子苷對(duì)照品(美國SIGMA 公司，批號(hào)為101016464，含量≥99.0%);尿酸(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑進(jìn)口分裝，批號(hào)為0001211);水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑皆為分析純。

Waters 2695 高效液相色譜儀，Waters 2996 DAD檢測(cè)器，Waters Empower 工作站;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鞏義市予華儀器責(zé)任有限公司);FE20 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);電子天平(千分之一，上海精密科學(xué)儀器有限公司);電子天平(萬分之一，十萬分之一，德國賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)。

1.2 研究對(duì)象

7 周齡雄性SPF 級(jí)昆明小鼠，體重18～22 g，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(渝)2012-0007。

1.3 研究方法

1.3.1 提取液的制備

①滅活(MHSTY)菥蓂水提液的制備:稱取經(jīng)烘箱120 ℃滅活40 min 的菥蓂藥材粗粉100 g，加水1L 回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至100 mL，即得含生藥材1 g/mL 的水提液;②未滅活(WMHSTY)菥蓂水提液的制備:稱取菥蓂藥材粗粉100 g，加水1 L 回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，濃縮至100 mL，即得含生藥材1 g/mL 的水提液;③菥蓂醇提液(CTY)的制備:稱取菥蓂藥材粗粉100 g，加乙醇1 L 回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇至無醇味，加水稀釋至100 mL，即得含生藥材1 g/mL 的醇提液;④菥蓂水提醇沉濃縮液(STCCNSY)的制備:稱取菥蓂藥材粗粉300 g，按“①”方法制備菥蓂水提液300 mL，加乙醇至含醇量為50%進(jìn)行醇沉，靜置冷藏24 h，回收乙醇并濃縮至100 mL，即得含生藥材3 g/mL 的濃縮液。分別取上述提取液1.0 mL，加水5.0 mL 稀釋，濾過，取續(xù)濾液10 μL 進(jìn)樣，供HPLC 分析。

1.3.2 黑芥子苷HPLC 分析方法的建立

1.3.2.1 HPLC 條件

Boston ODS C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:0.02 M C16H37NO4S 水溶液(用1.3 M氫氧化鈉和0.4 M 磷酸二氫鈉水溶液調(diào)pH=7)-乙腈(85∶15);柱溫25 ℃，檢測(cè)波長225 nm，流速1 mL/min。

1.3.2.2 線性關(guān)系考察

精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h 的黑芥子苷對(duì)照品10.50 mg 置25 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL 含0.42 mg 黑芥子苷的儲(chǔ)備液。精密吸取適量儲(chǔ)備液以甲醇配制成不同濃度(0.021、0.084、0.168、0.336 mg/mL)的對(duì)照品溶液，按“1.3.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣分析。以峰面積(Y)對(duì)濃度(X)進(jìn)行回歸，回歸方程為Y=9.82×106X+1.84×104(r=0.99995)。結(jié)果表明黑芥子苷在0.021～0.42 mg/mL 內(nèi)色譜峰面積與濃度的線性關(guān)系良好。

1.3.2.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取黑芥子苷對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次進(jìn)樣10 μL，按“1.3.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定，并計(jì)算6 次峰面積的RSD%為1.02%，表明儀器精密度良好。

1.3.2.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取藥材粗粉100 g，按“1.3.1①”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按“1.3.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定各樣品中黑芥子苷含量，并計(jì)算RSD 值為1.68%，表明本方法重現(xiàn)性好。

1.3.2.5 加樣回收率試驗(yàn)

稱取藥材粗粉50 g，加入黑芥子苷對(duì)照品18.25 mg，按“1.3.1①”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按“1.3.2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定各供試品溶液中黑芥子苷含量，并計(jì)算平均回收率為99.12%，RSD 值為2.38%。

1.3.3 動(dòng)物分組與給藥

昆明小鼠隨機(jī)分為7 組:模型組、空白對(duì)照組、陽性組、未滅活水提液(WMHSTY)組、滅活水提液(MHSTY)組、醇提液(CTY)組和水提醇沉濃縮液(STCCNSY)組。每組灌服相應(yīng)藥物，給藥劑量為5.0 g/kg，陽性對(duì)照組給予別嘌醇片0.12 g/kg，模型組與對(duì)照組給予等量蒸餾水。各組均灌胃給藥5 d，每日1 次，第5 d 給藥后造模:除正常對(duì)照組外，各組均腹腔注射黃嘌呤懸液0.02 mL/g，1 h 后摘眼球法取血，3000 rpm 離心，檢測(cè)血清中尿酸含量。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 黑芥子苷含測(cè)結(jié)果

HPLC 色譜圖見圖1，含測(cè)結(jié)果(表1)表明，菥蓂醇提液中黑芥子苷的含量最高，其次為滅活水提液，濃縮液中未檢測(cè)出黑芥子苷。

Fig.1 HPLC chromatograms of standard(A)，CTY(B)and STCCNSY(C)

表1 藏藥菥蓂提取液中黑芥子苷的含量Table 1 Content of sinigrin in different extracts of T.awogrlse

2.2 MHSTY 與WMHSTY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響

表2 MHSTY 與WMHSTY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型尿酸的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of MHSTY and WMHSTY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

表2 MHSTY 與WMHSTY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型尿酸的影響(±s，n=10)Table 2 Effect of MHSTY and WMHSTY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

注:與模型組相比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

結(jié)果見表2，與對(duì)照組比，模型組尿酸值顯著升高，表明造模成功。與模型組比，MHSTY 和WMHSTY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型均有顯著降低尿酸作用，其中MHSTY 有極顯著降低尿酸作用。

2.3 WMHSTY 和CTY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響

結(jié)果見表3，與對(duì)照組比，模型組尿酸值顯著升高，表明造模成功。與模型組比，CTY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型無明顯影響，WMHSTY 對(duì)該模型有顯著降低尿酸作用，表明菥蓂治療痛風(fēng)的有效作用部位在水提液部位。

表3 WMHSTY 和CTY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of WMHSTY and CTY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

表3 WMHSTY 和CTY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響(±s，n=10)Table 3 Effect of WMHSTY and CTY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

注:與模型組相比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

2.4 STCCNSY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響

結(jié)果見表4，與對(duì)照組比，模型組尿酸值顯著升高，表明造模成功。與模型組比，STNSY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型有極顯著降低尿酸作用。

表4 STCCNSY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of STNCCNSY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

表4 STCCNSY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of STNCCNSY on uric acid level of high uric acid in mice induced by xanthanine(±s，n=10)

注:與模型組相比較，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01。Note:Compared with model group，* P＜0.05，＊＊ P＜0.01.

2.5 黑芥子苷含量與菥蓂對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型作用的關(guān)系

圖2 表明，藏藥菥蓂提取液中，CTY 中黑芥子苷含量最高，其次為WMHSTY，STCCNSY 中HPLC 法無法檢測(cè)出黑芥子苷;MHSTY 和STCCNSY 對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型有極顯著降低尿酸作用，WMHSTY 對(duì)本模型有顯著作用，而CTY 對(duì)該模型無明顯作用。表明藏藥菥蓂中黑芥子苷與其對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型作用無明顯關(guān)系，其物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步研究。

圖2 藏藥菥蓂中黑芥子苷含量與菥蓂對(duì)黃嘌呤致小鼠高尿酸模型作用的關(guān)系Fig.2 The relationship between sinigrin content in different extracts of T.awogrlse and their effects on high uric levels

3 結(jié)論

本試驗(yàn)中水提醇沉濃縮液中無法檢測(cè)出黑芥子苷成分，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明黑芥子苷對(duì)熱不穩(wěn)定。黑芥子苷是一種硫苷，它既能溶于水，又能溶于乙醇或含水醇，在常溫、干燥條件下相對(duì)穩(wěn)定，但在濕熱條件下，易發(fā)生有酶(芥子酶)降解與無酶降解，其降解速率與溫度和體系含水量有關(guān)，溫度越高，含水量越高，降解越快。含有苷類等次生代謝產(chǎn)物的天然藥物細(xì)胞內(nèi)一般同時(shí)含有能分解苷類成分的酶，如黃芩苷、龍膽苦苷等。由于溫濕度對(duì)黑芥子苷的穩(wěn)定性有一定影響，故本實(shí)驗(yàn)采用了鼓風(fēng)加熱的方式迅速殺酶，而不是傳統(tǒng)的蒸、清炒、燀等方法。預(yù)試驗(yàn)以黑芥子苷含量為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)法對(duì)藏藥菥蓂藥材滅活工藝主要影響因素滅活溫度(110、120 和130℃)和滅活時(shí)間(20、40 min 和60 min)進(jìn)行了考察，優(yōu)選出120 ℃下鼓風(fēng)加熱40 min 的滅活條件。

菥蓂經(jīng)水提后收膏率約16%，就單味藥而言，出膏率過高，不利于制劑成型工藝研究。水提醇沉法是較傳統(tǒng)的一種除雜方法，其基本原理是根據(jù)物質(zhì)溶解度差別進(jìn)行分離，使一部分物質(zhì)沉淀析出。具有操作簡便，乙醇沸點(diǎn)適中，回收乙醇可重復(fù)使用的特點(diǎn)，能降低成本。本實(shí)驗(yàn)以黑芥子苷為含測(cè)指標(biāo)，結(jié)合藥效試驗(yàn)結(jié)果，采用單因素試驗(yàn)對(duì)菥蓂水提醇沉工藝主要影響因素乙醇含量(30%、50% 和70%)、藥液濃度(以生藥量計(jì)，0.5、1.0 g/mL 和2.0 g/mL)和醇沉?xí)r間(6、12 h 和24 h)進(jìn)行了系統(tǒng)考察，優(yōu)選出1.0 g/mL 藥液濃度加乙醇至含醇量為50%，醇沉24 h 的醇沉工藝條件。

菥蓂為藥食兩用的藏藥，西藏民間常用來治療痛風(fēng)。目前對(duì)藏藥菥蓂的現(xiàn)代藥理學(xué)研究較少，未見文獻(xiàn)報(bào)道，其治療痛風(fēng)的物質(zhì)基礎(chǔ)不清楚。據(jù)報(bào)道，黑芥子苷能有效治療痛風(fēng)［12-14］。本文采用化學(xué)與藥效評(píng)價(jià)相結(jié)合的試驗(yàn)方法，對(duì)藏藥菥蓂中黑芥子苷與菥蓂治療痛風(fēng)的關(guān)系進(jìn)行研究。結(jié)果表明，藏藥菥蓂治療痛風(fēng)作用與其中所含的黑芥子苷無明顯作用關(guān)系，其物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步研究。

課題組旨在研究菥蓂治療痛風(fēng)的作用及其物質(zhì)基礎(chǔ)，主要藥效學(xué)研究通常需采用兩種及兩種以上的試驗(yàn)方法來互相佐證，而本文僅采用了黃嘌呤致小鼠高尿酸這一模型對(duì)其進(jìn)行研究，不足以斷定菥蓂對(duì)痛風(fēng)的作用。作者將采用尿酸鈉(MSU)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證菥蓂中黑芥子苷與菥蓂治療痛風(fēng)的關(guān)系。

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