勃氏甜龍竹水對高血脂大鼠降血脂作用及脂代謝相關(guān)基因表達的影響

鐘祿彪，徐永敏，鄧杰文，馮 悅，王 成，李 崢，夏雪山*

1 昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明 650500;2普洱市滇潤農(nóng)業(yè)科技有限公司，普洱 666500;3 云南省第一人民醫(yī)院檢驗科，昆明 650500

隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)及生活方式的變化，我國高脂血癥(Hyperlipidemia，HLP)的發(fā)病率逐年增高，發(fā)病的年齡也趨于年輕化。由于血液中的脂質(zhì)成分含量的異常增高，高血脂癥已成為導(dǎo)致脂肪肝和心血管疾病的首要因素，臨床表現(xiàn)為冠心病、心絞痛、腦梗塞、腎損害等動脈栓塞性疾?。?］。目前，臨床主要的降血脂藥物有他汀類、貝特類、煙酸類、樹脂類、膽固醇吸收抑制劑五大類［2］。但由于現(xiàn)有藥物均存在一定的毒副作用，其臨床應(yīng)用受到一定限制，研究和開發(fā)具有降血脂作用的天然藥物或保健品已成為廣大醫(yī)藥工作者關(guān)注的熱點。

勃氏甜龍竹屬禾本科竹亞科牡竹屬大型叢生竹類，分布于亞洲熱帶和南亞熱帶的緬甸、老撾、越南、泰國、印度及中國云南南部。其鮮筍甘甜味美、可生食、營養(yǎng)價值極高，是我國所有筍用竹中糖分和谷氨酸含量最高的竹種。在普洱地區(qū)獨特的地理環(huán)境及氣候條件下，甜龍竹可利用發(fā)達根系將水分通過白天蒸騰從竹子導(dǎo)管中輸送到頂部，夜間回流殘留在竹節(jié)中的水成為竹水。當(dāng)前存在關(guān)于竹子水的保健品主要有:竹汁藥酒、竹汁飲料等，相關(guān)產(chǎn)品功效研究均認(rèn)為勃氏甜龍竹水在降血脂方面的保健作用［3］，但該作用的科學(xué)實驗證實報道的比較少，其作用的分子機制也不明確。

本研究旨在通過建立高血脂大鼠模型，觀察甜龍竹水對實驗性高血脂大鼠血清總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)等含量的影響，并探討其可能的降血脂作用分子機制，以期為高血脂等脂質(zhì)代謝紊亂相關(guān)疾病防治提供更安全有效的措施。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物

成年雄性SD 大鼠28 只，體重220±15 g，購買于昆明醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滇)2005-0008，實驗動物使用許可證號:SYXK(滇)2005-0004。

1.1.2 飼料

基礎(chǔ)飼料由昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供;高脂飼料為3.00%膽固醇、10.00%豬油、0.50%膽酸鈉、0.20%丙基硫氧嘧啶、5.00%白糖和81.30%基礎(chǔ)飼料制成。

1.1.3 勃氏甜龍竹水

勃氏甜龍竹水，云南省思茅地區(qū)由勃氏甜龍竹開發(fā)公司提供。選擇生長于普洱郊區(qū)的成體勃氏甜龍竹，在竹子下部竹莖部分人工鑿孔，竹水自然流出，靜置或離心去沉淀，取上清液，用真空保鮮機將取得上清液用高質(zhì)朔料密封包裝，將封裝好的水于-20℃長期保存，待用時再暫存于4 ℃融化后使用。

1.2 實驗方法

1.2.1 勃氏甜龍竹水制備及成分分析

勃氏甜龍竹水經(jīng)冷凍干燥機處理得到凍干物。取約200 mg 凍干物于15 mL 離心管中，加入2 mL分析純甲醇，震蕩2 min，再超聲萃取5 min，然后離心分層，取上清液濃縮至200 μL，檢測勃氏甜龍竹水常規(guī)成分?？傸S酮、總酚、總糖和總蛋白質(zhì)含量的測定方法均為國標(biāo)方法中的分光光度計比色法，氨基酸含量的測定方法為AccQ-Tag 柱前衍生法。這五項指標(biāo)均由云南省測試分析中心完成。

1.2.2 高血脂(HLP)大鼠模型的建立

清潔級雄性SD 大鼠28 只，體重220±15 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機分為四組，每組7 只。空白對照組全程用普通飼料、普通水予以飼喂，前2 周腹腔安慰性注射1 mL 的生理鹽水注射。模型組、治療組、預(yù)防組前8 周均予以高脂飼料的飼喂，并在前兩周每周一次腹腔注射維生素D3(VD3)注射液60 萬IU/kg;模型組在第8 周空腹采血檢測血脂指標(biāo)，確定高脂血癥是否發(fā)生，并繼續(xù)給予高脂飼料、普通水飼喂;治療組在建模8 周后，開始飲用勃氏甜龍竹水，至16 周實驗結(jié)束;預(yù)防組建模過程中同時飲用勃氏甜龍竹水，直至16 周實驗結(jié)束。

1.2.3 樣本采集與血脂生化指標(biāo)測定

在第8 周、16 周將4 組大鼠均禁食12 h 后，尾靜脈采血，3000 rpm 離心10 min，分離血清，檢測血脂主要指標(biāo)。血清總膽固醇(TC)的檢驗方法為酶法，高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDLC)的檢驗方法為直接一步法，這三項血脂生化指標(biāo)均由云南省第一人民醫(yī)院檢驗科用全自動生化分析儀(雅培Ci1620)進行測定。

表1 高血脂大鼠建模與治療、預(yù)防分組Table 1 Grouping and treatment in rats

1.2.4 ABCA1、LXRα 基因mRNA 表達量定量測定為了進一步探討勃氏甜龍竹水降血脂機制，在第16 周將各組大鼠斷頸處死，提取肝臟組織總RNA。根據(jù)大鼠ABCA1、LXRα 兩個基因及內(nèi)參基因GAPDH 基因序列設(shè)計引物(表2)［4，5］，將肝臟提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA 為模板，以GAPDH 為內(nèi)參基因，應(yīng)用SYBR Green I 實時熒光PCR相對定量法，測定與血脂相關(guān)的ABCA1、LXRα 兩個基因mRNA 的表達量。

表2 熒光實時定量PCR 引物序列Table 2 Real-time PCR primers sequences

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行比較分析，Prism5 繪制圖表。多組間平均值比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較時選擇最小顯著差異法(LSD)分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 勃氏甜龍竹水的化學(xué)成分

檢測結(jié)果顯示:甜龍竹水凍干物中總糖含量為25.3%，總黃酮含量為0.085%，總酚含量為0.35%，蛋白質(zhì)含量為11.4%，總氨基酸含量為8.114%。共含有16 種氨基酸，其中有7 種為必需氨基酸，分別為纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、蘇氨酸、賴氨酸。

2.2 高脂模型的建立

模型組大鼠飼喂高脂飼料8 周后，采集靜脈血，測定血脂相關(guān)指標(biāo)。經(jīng)檢測分析發(fā)現(xiàn)，與飼喂普通飼料的空白對照組相比較，模型組總膽固醇(TC)為7.02±2.27 mmol/L，是空白對照組的5.75 倍;低密度脂蛋白(LDL-C)是3.06±1.23 mmol/L，是空白對照組的34 倍;高密度脂蛋白(HDL-C)是1.08±0.29 mmol/L，是空白對照組的1.77 倍。模型組TC、LDL-C 極顯著增高(P＜0.01)，HDL-C 也顯著增高(P＜0.05)，符合高脂血癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］，表明SD 大鼠高血脂模型建模成功(表3)。

表3 高脂大鼠模型主要血脂指標(biāo)(n=7，±s)Table 3 The major lipid parameters of HLP model(n=10，±s)

表3 高脂大鼠模型主要血脂指標(biāo)(n=7，±s)Table 3 The major lipid parameters of HLP model(n=10，±s)

注:與空白對照組比較，a:P＜0.05;b:P＜0.01。Note:a:P＜0.05;b:P＜0.01，compare with control.

2.3 勃氏甜龍竹水對高血脂大鼠模型的降血脂效果

為了檢測勃氏甜龍竹水對高血脂癥大鼠的降血脂效果，治療組在建模成功后的9～16 周飲用勃氏甜龍竹水，在繼續(xù)飼喂高脂飼料的情況下，至16 周時治療組的總膽固醇(TC)為11.88±1.46 mmol/L，是模型組的1.08 倍;低密度脂蛋白(LDL-C)為5.77±0.48 mmol/L，是模型組的1.09 倍;高密度脂蛋白(HDL-C)為1.22±0.16 mmol/L，是模型組的1.20倍。治療組的TC、LDL-C、HDL-C 與模型組無顯著性差異(P＞0.05)。此結(jié)果表明，勃氏甜龍竹水對已經(jīng)發(fā)生的高血脂癥無顯著的治療效果(表4)。

在建模同時飼喂勃氏甜龍竹水的預(yù)防組，至16周檢測血脂相關(guān)指標(biāo)。與模型組相比較，預(yù)防組的總膽固醇(TC)為8.53±1.07 mmol/L，降低了22.4%;低密度脂蛋白(LDL-C)為3.52±0.78 mmol/L，降低了33.5%;高密度脂蛋白(HDL-C)為1.41±0.09 mmol/L，升高了38.2%?？偰懝檀?TC)和低密度脂蛋白(LDL-C)均明顯低于未飲用勃氏甜龍竹水的模型組(P＜0.05)，高密度脂蛋白(HDL-C)水平則要顯著高于模型組(P＜0.05)，表明在高脂飼料同時配合飲用勃氏甜龍竹水，可以有效地改善高血脂相關(guān)指標(biāo)，勃氏甜龍竹水具有顯著的高血脂發(fā)生預(yù)防效果。

表4 勃氏甜龍竹水對高血脂大鼠的治療效果(n=7，±s)Table 4 Effect of D.brandisii juice on HLP rats(n=10，±s)

表4 勃氏甜龍竹水對高血脂大鼠的治療效果(n=7，±s)Table 4 Effect of D.brandisii juice on HLP rats(n=10，±s)

注:與模型組比較，a P＜0.05;bP＜0.01。Note:a P＜0.05;b P＜0.01，compare with model.

2.4 勃氏甜龍竹水改善高脂飲食大鼠脂質(zhì)代謝作用的分子機制

根據(jù)溶解曲線分析，內(nèi)參基因GAPDH、ABCA1和LXRα 的溶解溫度分別為83、82.5 ℃和85.5 ℃，3 個基因片段的溶解曲線均為單一峰，并且峰尖無切跡，說明產(chǎn)物特異性較高(圖1)。

圖1 GADPH(內(nèi)參基因，A)、ABCA1(B)與LXRα(C)的溶解曲線Fig.1 Melting curve of GAPDH(A)，ABCA1(B)and LXRα(C)genes

由圖2 可見，內(nèi)參基因GAPDH、ABCA1 和LXRα 的擴增效率(Amplification efficiency，E values)和相關(guān)系數(shù)(Correlation coefficients，R2values)分別為:GAPDH(E=109.2%，R2=99.1%)，ABCA1(E=90.0%，R2=99.6%)，LXRα(E=99.2%，R2=98.7%)，3 個基因片段的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)(R2)均大于98%，表明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較理想。

圖2 GAPDH(內(nèi)參基因，A)、ABCA1(B)與LXRα(C)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curves of GAPDH(A)，ABCA1(B)and LXRα(C)genes

不同處理的大鼠，在第16 周取肝組織，提取總RNA，并檢測血脂代謝相關(guān)基因的表達。結(jié)果顯示，治療組和預(yù)防組經(jīng)過不同時間的勃氏甜龍竹水飼喂，其ABCA1 基因的mRNA 表達量卻分別是模型組的1.45 倍、1.90 倍，顯著性高于模型組(P＜0.05)。結(jié)果表明，飼喂高脂飼料的同時飲用勃氏甜龍竹水，可以顯著地增加ABCA1 基因mRNA 的表達量(圖3)。

圖3 各組大鼠ABCA1 基因和LXRα 基因mRNA 的相對表達量Fig.3 The mRNA expressions of ABCA1 and LXRα genes

由圖3 可見，治療組和預(yù)防組大鼠，飲用勃氏甜龍竹水，其LXRα 基因的mRNA 表達量是模型組的1.85 倍和1.94 倍，顯著高于模型組(P＜0.05)。此結(jié)果表明，不管在高脂飲食的過程中還是在高脂飲食之后飲用甜龍竹水均可以有效地增加LXRα 基因mRNA 的表達量。

3 討論

建立大鼠高血脂模型的方法主要有:喂養(yǎng)法、免疫刺激法、機械損傷法等［7］，通過比較各類方法的優(yōu)缺點及本實驗室條件選擇喂養(yǎng)法，利用喂給高脂飼料同時前兩周輔于維生素D3 注射，經(jīng)過8 周成功的建立了大鼠高血脂動物模型，檢測高脂模型組大鼠血清的TC、LDL-C 及HDL-C 含量，發(fā)現(xiàn)其明顯高于空白對照組(P＜0.05)，因此采用此方法所建立的高血脂大鼠模型的方法是有效的。

高脂血癥嚴(yán)重影響人體的身體健康和生活質(zhì)量，大量臨床結(jié)果顯示，TC 和LDL-C 與冠心病發(fā)生率都呈正相關(guān)，LDL-C 是冠心病的主要因素。降低LDL-C 可使冠心病發(fā)生率明顯下降［8-10］。研究通過對建立的高血脂大鼠模型，飲用勃氏甜龍竹水并比較主要血脂指標(biāo)變化，發(fā)現(xiàn)勃氏甜龍竹水能明顯的降低預(yù)防組大鼠血液TC 和LDL-C 的水平。LDL-C是人體血漿膽固醇的主要載體，LDL 分子內(nèi)的膽固醇是通過受體機制運至細(xì)胞加以利用的，過剩的膽固醇在細(xì)胞內(nèi)，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞堆積，這是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的主要原因。因此，降低血脂LDL-C 的水平說明勃氏甜龍竹水具有降低血脂的作用。勃氏甜龍竹水盡管對預(yù)防組和治療組表現(xiàn)出不同的降低TC 和LDL-C 作用，但是卻一致地表現(xiàn)出了升高HDL-C 的效果。HDL 作為膽固醇的受體與膽固醇結(jié)合形成HDL-C，然后通過血液循環(huán)送入肝臟細(xì)胞中，膽固醇形成膽汁酸排出體外而被消除，從而達到減少血管壁上的膽固醇，起疏通血管，以致血脂降低，即人體血清中的HDL 是心腦血管疾病的保護因子。HDL-C 水平的升高，從另外一個方面說明勃氏甜龍竹水具有降低血脂的作用。

ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)子A1(ATP-Binding Cassette Transporter A1，ABCA1)所介導(dǎo)的膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(revere cholesterol transport，RCT)是膽固醇外流的初始步驟，其在RCT 過程中起著重要的作用，使血液中HDL-C 濃度增加，將外周組織中的膽固醇通過血液循環(huán)送入肝細(xì)胞中，膽固醇形成膽汁酸排出體外而被消除，從而降低血清TC。LXRα 基因是細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)配體和它結(jié)合后而被激活，啟動ABCA1 靶基因，促進ABCA1 靶基因的轉(zhuǎn)錄。研究通過分析各組大鼠肝組織中與脂代謝相關(guān)的ABCA1 和LXRα 兩個基因mRNA 的相對表達量，發(fā)現(xiàn)飲用不同時間勃氏甜龍竹水的治療組和模型組卻一致表現(xiàn)出ABCA1 基因mRNA、LXRα 基因mRNA 的表達增強，據(jù)此推斷竹水導(dǎo)致HDL-C 濃度升高，可能與ABCA1 基因mRNA、LXRα 基因mRNA 的表達量升高相關(guān)。這與Attie 等［11-13］所報道的LXRα、ABCA1的表達水平與血漿中HDL 水平呈正相關(guān)的結(jié)論相符。另外，ABCA1 和LXRα 兩個基因表達量的升高，在促進HDL-C 合成的同時，也將外周組織中的膽固醇通過血液循環(huán)送入肝細(xì)胞中，膽固醇形成膽汁酸排出體外而被消除，從而降低血清TC 含量。勃氏甜龍竹水通過:LXRα→ABCA1→HDL-C 途徑發(fā)揮降血脂作用，與促進膽固醇逆轉(zhuǎn)運的報道一致［14-16］。

勃氏甜龍竹水主要含有總糖、總酚、總黃酮、總蛋白及7 種必需氨基酸等成分，其降血脂的作用可能通過所含多糖與血清中的脂類物質(zhì)結(jié)合，參與脂質(zhì)代謝活動，使血清中的脂類物質(zhì)容易排出［17］。竹水中含有的黃酮類物質(zhì)則通過調(diào)節(jié)血液中脂蛋白，抑制血小板聚集，調(diào)節(jié)一些酶類，最終對心血管系統(tǒng)起到重要調(diào)節(jié)作用［18］。其所含有的總糖、總黃酮、總酚都具有一定的抗氧化能力，可能是調(diào)節(jié)高血脂癥所引起機體氧化與抗氧化狀態(tài)，從而提高機體抗氧化酶活性，提高體內(nèi)脂質(zhì)代謝［19］。另外，總蛋白及7 種必需氨基酸，能夠維持人體所需氨基酸之間的平衡及代謝，調(diào)節(jié)機體生理功能，增強機體抵抗能力等［20］。對于勃氏甜龍竹水何種成分起到有降血脂作用，還有待進一步的研究。

綜上所述，勃氏甜龍竹水具有一定降血脂和預(yù)防高血脂產(chǎn)生的作用。我國云南省思茅地區(qū)竹子資源豐富，勃氏甜龍竹廣泛種植，竹水降血脂作用的發(fā)現(xiàn)有利于更大范圍的開發(fā)勃氏甜龍竹資源，促進農(nóng)民增收致富。

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