玄參飲片質(zhì)量控制方法研究

賈成友，張傳輝，趙鳳平，傅 亞，王云紅*，楊榮平*

1 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137;2 重慶市中藥研究院，重慶 400065;3重慶科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，重慶 401331

玄參系玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，具有涼血滋陰、瀉火解毒的功效，主產(chǎn)于浙江、四川、湖北、安徽、江蘇等地。玄參藥用歷史悠久，栽培地區(qū)廣泛，具有多種類型的種質(zhì)［1］，且炮制方法多樣，具有凈制、切制、單純加熱制、輔料制等［2］。2010 年版《中國藥典》(一部)規(guī)定玄參飲片中哈巴苷和哈巴俄苷的總量不得少于0.45%［3］，鑒于中藥成分的復(fù)雜性，多指標(biāo)成分同時(shí)測定也并非能將所有活性成分定量。因此，本研究在測定16批重慶市售玄參飲片中哈巴苷和哈巴俄苷含量的基礎(chǔ)上，對其合格者進(jìn)行了指紋圖譜研究［4-7］，并采用聚類分析(Cluster analysis)、主成分分析(Principal component analysis)等方法［8-10］探究重慶市售玄參飲片質(zhì)量情況，以期為玄參飲片質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)提升提供更好的技術(shù)手段和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

20A 系列HPLC 儀(配備二元泵，在線脫氣，DAD 檢測器，自動進(jìn)樣器，柱溫箱，日本島津公司)，CPA 225D 型電子天平(十萬分之一，德國Sartorius公司)，BS 224S 型電子天平(萬分之一，德國Sartorius 公司)，DHG-9240A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)。

哈巴苷(批號FY12871128)、哈巴俄苷(批號FY12861116)對照品購自南通飛宇生物科技有限公司，肉桂酸(批號110786-200503)對照品購自中國藥品生物制品檢定所，所有對照品經(jīng)HPLC 峰面積歸一化法檢測純度均高于98%，乙腈、甲醇均為色譜純，磷酸、冰醋酸為分析純，水為自制超純水。

1.2 樣品來源

玄參飲片購于重慶桐君閣中藥批發(fā)商及桐君閣藥房、萬鑫藥房、和平藥房、康濟(jì)大藥房等各大藥店，經(jīng)重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 一測多評法測定肉桂酸、哈巴苷和哈巴俄苷的含量

1.3.1.1 色譜條件

色譜柱:Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相:0.1%磷酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，0～10 min，3%B;10～20 min，3%～22%B;20～60 min，22%B;60～70 min，22%～3%B，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫35℃。

1.3.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥10 h 的肉桂酸、哈巴俄苷和哈巴苷對照品適量，加30%甲醇制成每1 mL 含肉桂酸4.098 μg、哈巴俄苷9.6 μg、和哈巴苷58.2 μg 的混合對照品溶液，即得。

1.3.1.3 供試品溶液的制備

取玄參藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)45 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

筆者在前期研究中已建立采用HPLC 法同時(shí)測定玄參藥材及飲片中哈巴苷和哈巴俄苷含量的一測多評評價(jià)模式［11］，鑒于已另文發(fā)表，這里僅作簡要闡述:以肉桂酸為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，按照公式fs/k=fs/fk=(Cs×Ak)/(Ck×As)(式中CS為內(nèi)標(biāo)物濃度，AS為內(nèi)標(biāo)物峰面積，Ck為待測成分對照品k 的濃度，Ak為待測成分對照品k 的峰面積)計(jì)算得到肉桂酸對哈巴苷和哈巴俄苷的校正因子(RCF)分別為f肉桂酸/哈巴苷=0.0607，f肉桂酸/哈巴俄苷=0.3040。精密吸取肉桂酸系列濃度對照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，對照品質(zhì)量(X，μg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=6465700X-4021.3(r=0.9999)，線性范圍0.008196～0.122940 μg，結(jié)果表明，肉桂酸在相應(yīng)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2 玄參飲片指紋圖譜分析

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱:Inertsustain C18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動相:1%冰醋酸水溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫，0～20 min，5%～30%B;20～40 min，30%～45%B;40～50 min，45%～65%B;50～60 min，65%～100%B;進(jìn)樣量10 μL，檢測波長290 nm，流速1 mL/min，柱溫30 ℃。

1.3.2.2 對照品溶液的制備

對照品溶液的制備方法同“1.3.1.2”。

1.3.2.3 供試品溶液的制備

取玄參藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，浸泡1 h，超聲處理(功率500 W，頻率40 kHz)60 min，放冷，再稱定重量，用80%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一份供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測定，記錄峰面積。結(jié)果以肉桂酸峰的保留時(shí)間和峰面積為對照，各共有峰的相對保留時(shí)間和峰面積比值基本一致，其RSD 均小于3.0%，相似度均在0.99 以上，符合指紋圖譜技術(shù)的要求，表明儀器精密度良好。

1.3.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別于0、4、8、12、24、36 h，精密吸取同一份供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，依法測定，記錄峰面積。結(jié)果以肉桂酸峰的保留時(shí)間和峰面積為對照，各共有峰的相對保留時(shí)間和峰面積比值基本一致，其RSD 均小于3.0%，相似度均在0.99 以上，符合指紋圖譜技術(shù)的要求，表明供試品溶液在36 h 內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次的玄參藥材粉末(過三號篩)6 份，每份約0.5 g，依法制備供試品溶液，分別進(jìn)行測定，記錄峰面積。結(jié)果以肉桂酸峰的保留時(shí)間和峰面積為對照，各共有峰的相對保留時(shí)間和峰面積比值基本一致，其RSD 均小于3.0%，相似度均在0.99 以上，符合指紋圖譜技術(shù)的要求，表明本方法穩(wěn)定，可靠，具有較好的重復(fù)性。

1.3.2.7 耐用性試驗(yàn)

分別考察一定范圍內(nèi)流動相梯度、柱溫、檢測波長、流速變化，以及采用3 根不同的色譜柱Inertsustain C18、Waters C18、Diamonsil C18(均為4.6 mm×250 mm，5 μm)進(jìn)行測定對儀器色譜行為變化的影響，結(jié)果各條件下所測各主要色譜峰相對保留時(shí)間RSD 在0.812%～2.671%之間，相對峰面積比值RSD 在0.99%～2.74%之間，表明本方法具有較好的耐用性。

1.3.3 聚類分析［8］

根據(jù)指紋圖譜分析結(jié)果，將篩選出的11 批玄參飲片主要共有峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0 軟件，采用歐式距離平方、組間平均連接法對11 批飲片進(jìn)行聚類分析。

1.3.4 主成分分析［9，10］

將11 批重慶市售玄參飲片指紋圖譜中所確定的主要共有峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0 軟件，依法分析，取特征值較為明顯的兩個(gè)組成分(方差貢獻(xiàn)率≥60%)的得分做向量圖，進(jìn)行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16 批玄參飲片中肉桂酸、哈巴苷和哈巴俄苷的含量測定

采用所建立的一測多評法對所購16 批玄參飲片中哈巴苷和哈巴俄苷含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。

表1 玄參飲片中哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量Table 1 The contents of harpagide，cinnamic acid and harpagoside in R.scrophulariae pieces

由表1 可知，16 批玄參飲片中只有11 批滿足2010 年版《中國藥典》(一部)玄參飲片含量測定項(xiàng)下要求，將合格飲片依次標(biāo)為S1～S11 表示。可見，合格飲片中哈巴苷、肉桂酸和哈巴俄苷含量均高于不合格者，表明通過指標(biāo)成分控制飲片質(zhì)量具有一定的可行性。但合格玄參飲片中哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量及哈巴苷哈巴俄苷總含量的RSD 分別為34.22%、52.42%、47.53%、13.41%，表明不同飲片間哈巴苷、肉桂酸、哈巴俄苷含量的RSD 差異較大，僅通過指標(biāo)成分的方法控制藥材的質(zhì)量具有一定的局限性，并非可以反映所有活性成分的信息。

因此，研究擬將一測多評含量測定技術(shù)相和指紋圖譜技術(shù)相結(jié)合，用于玄參飲片質(zhì)量控制和評價(jià)，旨在進(jìn)一步探索玄參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升的科學(xué)方法。

圖1 玄參飲片HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for 11 batches of R.scrophulariae pieces

2.2 玄參的指紋圖譜分析

2.2.1 指紋圖譜的建立及相似度評價(jià)

按照所建立的方法，以肉桂酸為參照物，利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004 A 版(國家藥典委員會)軟件對11 批合格玄參飲片進(jìn)行指紋圖譜測定，所得HPLC 指紋圖譜及生成的玄參飲片對照指紋圖譜見圖1、圖2，相似度計(jì)算結(jié)果見表2。

圖2 玄參飲片對照指紋圖譜Fig.2 Typical fingerprint of R.scrophulariae pieces

表2 相似度計(jì)算結(jié)果Table 2 Results of Similarity calculation

2.2.2 共有特征峰的標(biāo)定與色譜峰歸屬

對各批飲片進(jìn)行特征圖譜分析，共標(biāo)定了53 個(gè)共有峰，確定了18 個(gè)主要共有指紋峰，峰面積結(jié)果見表3。指定了其中7 個(gè)指紋圖譜共有峰，并對1、5、7 號色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，分別為哈巴苷，肉桂酸和哈巴俄苷。

表3 玄參飲片指紋圖譜共有峰峰面積Table 3 Peak area of common peaks in fingerprint of R.scrophulariae pieces

經(jīng)指紋圖譜分析發(fā)現(xiàn)，11 批玄參飲片相似度在0.731～0.960 之間，除S11 相似度為0.731 外，其余10 批次飲片整體上具有良好的相似性。然而，18個(gè)主要共有峰面積RSD 在12.5%～107.5%之間，非共有峰面積的比例在21.7%～41.4%之間，表明不同批次玄參飲片的化學(xué)成分種類和含量均存在一定的差異性，藥材質(zhì)量參差不齊，僅僅利用相似度及峰面積RSD 等方法無法全面客觀地體現(xiàn)飲片之間存在的差異性和一致性。因此，擬采用CA 和PCA相結(jié)合的方法對11 批飲片進(jìn)行共有模式識別研究。

2.3 聚類結(jié)果分析

采用上文方法，將18 個(gè)主要共有峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0 軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 聚類分析結(jié)果Fig.3 Results of cluster analysis

由圖3 可知，以α 線為界，飲片可聚類為3 類:I(S1、S10、S2、S8、S3、S5)，II(S4、S6、S9、S7)，III(S11)。其中，S1、S10、S2 與S8 聚為一類后又與S3、S5 聚為一類，表明飲片S1、S10、S2、S8、S3、S5 之間具有一定的統(tǒng)一性;I 類中，S1、S10、S2 聚為一類，S3、S5 聚為一類，S8 單獨(dú)聚為一類，表明同一類別中飲片又存在一定的差異性。同樣，S4、S6 與S9聚為一類后又與S7 聚為一類形成II，說明它們之間既有一定的統(tǒng)一性又存在一定的差異性。以β 線為界，飲片可聚類為2 類，S11 被單獨(dú)的分為一類(產(chǎn)地為浙江，其他飲片均來自川渝地區(qū))，其余樣品被聚為另一類。根據(jù)前文計(jì)算結(jié)果，S11 中哈巴苷與哈巴俄苷總含量為0.549%，高于S1、S2、S7、S8、S10，但與對照指紋圖譜比較相似度為僅為0.731，表明通過指標(biāo)成分控制藥材質(zhì)量具有局限性，不同產(chǎn)地的飲片之間存在著較大的地域性差異，聚類分析對玄參進(jìn)行化學(xué)模式識別具有一定的科學(xué)道理。

2.4 主成分結(jié)果分析

采用上文方法，將18 個(gè)主要共有峰面積導(dǎo)入SPSS 19.0 軟件，取特征值較為明顯的兩個(gè)組成分(方差貢獻(xiàn)率63.62%)的得分做向量圖，結(jié)果如圖3 所示。

圖4 主成分分析結(jié)果Fig.4 Results of principal component analysis

由圖4 可知，11 批飲片相對集中地分散于3 個(gè)部分，S4、S6、S7、S9 集中于a 部分，S1、S2、S3、S5、S8、S10 集中于b 部分，S11 遠(yuǎn)離其它批次集中于c部分。a、b、c 之間相對偏離較大，表明彼此之間成分差異性較大，該分析結(jié)果與聚類分析結(jié)果具有一致性。其中，a 部分4 個(gè)點(diǎn)分布較為離散，表明對應(yīng)4 個(gè)批次的飲片間存在著一定的差異性;b 部分又可以相對地分為兩部分:S10 與S1 極為接近，表明對應(yīng)的飲片具有顯著地相似性，S2、S3、S5、S8 同樣具有一定的相似性，表明S10 與S1 之間，S2、S3 與S5、S8 飲片之間成分較為接近，但是每一點(diǎn)之間又相對離散，說明各飲片之間存在一定的差異性;S11 因哈巴苷與哈巴俄苷總含量較高而單獨(dú)歸為一類。可知，主成分分析在一定程度上反映了玄參飲片之間存在的統(tǒng)一性及差異性，與聚類分析吻合性較好。

3 結(jié)論

重慶市售16 批玄參飲片中只有11 批飲含量符合2010 年版《中國藥典》規(guī)定，合格率僅為68.75%，說明目前藥材市場上玄參飲片質(zhì)量參差不齊。筆者經(jīng)過文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)影響玄參質(zhì)量的因素有很多，歸納起來主要有:玄參藥材生產(chǎn)過程中缺少質(zhì)量管理規(guī)范，不能從源頭上控制中藥飲片質(zhì)量，導(dǎo)致藥材不能達(dá)到“真實(shí)、優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定、可控”的標(biāo)準(zhǔn);中藥材市場經(jīng)營缺乏規(guī)范化管理，一些不法商販為牟取暴利以假摻雜或以次充好;玄參成分復(fù)雜，成分相互之間會發(fā)生很多化學(xué)反應(yīng)，外界條件稍有變化，即可能造成其成分存在明顯差異;玄參系大宗藥材，經(jīng)常與其他藥材混合存儲，儲存條件落后且重慶地區(qū)多高溫高濕天氣，易于產(chǎn)生蟲害和霉變而影響藥材質(zhì)量。以上種種皆可歸根于生產(chǎn)缺少規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)，如飲片在炮制中可能存在炮制不規(guī)范、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一等問題，筆者呼吁相關(guān)部門加大對玄參飲片炮制、質(zhì)量檢驗(yàn)地規(guī)范化管理。

一測多評法作為一種全新的多指標(biāo)質(zhì)量評價(jià)模式，實(shí)現(xiàn)了在對照品缺失的情況下，完成多指標(biāo)成分定量，達(dá)到真正對中藥內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行有效表征、綜合評價(jià)和全面控制的目的，對于中藥的質(zhì)量控制和評價(jià)模式具有重要作用。本研究在一測多評測定玄參飲片多指標(biāo)成分含量的基礎(chǔ)上，建立了玄參飲片的指紋圖譜，并結(jié)合聚類分析、主成分分析方法對玄參的質(zhì)量進(jìn)行綜合全面地評價(jià)，為玄參飲片質(zhì)量的控制和評價(jià)提供更好的技術(shù)參考，為玄參飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 Chen DX(陳大霞)，Li LY(李隆云)，Peng R(彭銳)，et al.Analysis of genetic difference among Scrophularia ningpoensis cultivars by SRAP.China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2009，34:138-142.

2 Zhang FK(張發(fā)科)，Lv QT(呂青濤)，Sun XM(孫秀梅)，et al.The analysis of Radix scrophulariae processing history.Shandong J Tradi Chin Med(山東中醫(yī)雜志)，2007，26:337-339.

3 Chinese Pharmacopoeia Commission(國家藥典委員會).Pharmacopoeia of the People’s Republic of China(中華人民共和國藥典).Beijing:China Medical Science Press，2010.VolⅠ，109.

4 State Drug Administration(國家藥品監(jiān)督管理局).An announcement of technical specifications for fingerprints of Chinese medical injection study，Temporary Execution.Drug Stand China(中國藥品標(biāo)準(zhǔn))，2000，1(4):3-7.

5 Dong L(董禮)，Xu L(許蕾)，Zhou YQ(周永強(qiáng))，et al.Application of chromatographic fingerprint in traditional Chinese medicine injections.Mod Med Health(現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生)，2011，27:1830-1832.

6 Liu HY(劉洪宇)，Cai TQ(蔡鐵全).A comparative study of HPLC fingerprints of Radix Scrophulariae.Chin Med Mat(中藥材)，2006，29:1295-1299.

7 Zhang H(張慧)，Lv JL(呂潔麗)，Zhang C(張崇)，et al.Chemical fingerprinting of water extracts of Radix angelicae Dahuricae using high performance liquid chromatography.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，25:506-510.

8 Wang Y(王硯)，Wang SL(王書林).HPLC fingerprinting and cluster analysis of Bupleurum plants.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2014，26:704-708.

9 Zhao G(趙剛)，Du W(杜瑋)，Wei YH(魏玉輝)，et al.HPLC-ELSD fingerprints of Yinhuang preparations.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2009，40:1053-1056.

10 Cui HH(崔紅花)，Guo J(郭嬌)，Gao YH(高幼衡)，et al.Principal component cluster analysis for Citrus medica var.sarcodactylia fruits and fingerprint identification of medicinal plants in Citrus L.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，2010，41:978-984.

11 Zhang CH(張傳輝)，Chen XC(陳小川)，F(xiàn)u Y(傅亞)，etal.Optimization of processing technology for Scrophularia ningpoensis by QAMS.World Sci Technol/Mod Tradit Chin Med Mater Med(世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化)，2015，17:254-260.