近紅外光譜法快速測定女貞子中特女貞苷的含量

張迪文，白 雁，謝彩俠，胡小莉，郝 敏，謝惠英

河南中醫(yī)學院藥學院，鄭州 450046

女貞子(Fructus Ligustri Lucidum)是木犀科植物女貞(Ligustrum lucidum Ait.)的干燥成熟果實，是一味傳統(tǒng)的扶正固本藥物，具有滋補肝腎、明目烏發(fā)之功效［1］。臨床主要用于眩暈耳鳴、腰膝酸軟、須發(fā)早白、目暗不明等癥［2］。女貞子含有多種化學成分，最先發(fā)現(xiàn)的是含有較高含量的齊墩果酸、乙酰齊墩果酸、熊果酸等［3］。2010 年版《中國藥典》收載的女貞子藥材的標準是以高效液相色譜法測定特女貞苷含量。供試品的制備要經(jīng)過精密稱定，加熱回流，補足失重等多個步驟，處理過程較為繁瑣復雜。

近紅外光譜技術結合了光譜衡量技術、化學計量學技術和基礎測量技術，能夠快速、高效、無損的對樣品進行定性和定量分析［4-6］。近紅外光譜技術通過對樣品一次測定，就可以在幾秒至幾分鐘內(nèi)同時測定一個樣品的幾種至十幾種性質數(shù)據(jù)［7］。本文對女貞子藥材中指標性成分特女貞苷的含量做了相關研究，并利用近紅外光譜技術上述優(yōu)點，結合偏最小二乘法建立女貞子藥材中特女貞苷含量的定量分析模型，為女貞子藥材的質量檢測與分析評價提供了快捷簡便的新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Nicolet 6700 型傅里葉變換近紅外光譜儀(配有InGaAs 檢測器，50 mL 標準石英樣品杯，漫反射積分球，樣品旋轉器以及OMNIC 光譜采集軟件，TQ Analyst 8.0 分析軟件，美國Thermo 公司)，SZ-93 型自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)，F(xiàn)W-200型高速藥材粉碎機(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，101A-2B 型電熱鼓風干燥箱(上海實驗儀器廠有限公司)，METTLER TOLEDO AL204 型1/萬分析天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，HS-6150 型超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

女貞子藥材為采購于四川、湖南、浙江、河南4個產(chǎn)地共91 份樣品，由河南中醫(yī)學院董誠明教授鑒定為木犀科女貞屬植物女貞(Ligustrum lucidum Ait.)的干燥成熟果實。

乙醇、蒸餾水均為分析純，甲醇為色譜純。

2 方法與結果

2.1 近紅外光譜的采集

取上述91 份樣品適量，粉碎，過40 目篩，取約5 g 粉末裝入石英杯，混合均勻，采用積分球漫反射，以空氣為參比，扣除背景采集光譜圖。采集參數(shù)如下:分辨率8 cm-1，光譜采集范圍12000～4000 cm-1，掃描次數(shù)64 次，每次掃描背景間隔20 min。溫度25～28 ℃，相對濕度17%～20%。每份樣品重復掃描3 次，求平均光譜，91 份樣品的近紅外光譜疊加圖見圖1。

圖1 91 份女貞子的近紅外原始光譜疊加圖Fig.1 The overlaid near-infrared reflectance spectra of 91 samples

2.2 特女貞苷參考值的HPLC 測定

參照2010 年版《中國藥典》一部中女貞子項下特女貞苷的HPLC 含量測定方法進行測定。本實驗采用的色譜條件:Dikma Diamonsil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相:甲醇-水(40∶60)，柱溫:30 ℃，進樣量:10 μL，流速:1 mL/min，檢測波長:224 nm。以保留時間定性，峰面積定量，外標法計算。每份樣品平行測定兩次，計算平均值，并以其作為參考值，女貞子藥材中特女貞苷的含量結果見表1。

表1 91 份女貞子藥材中特女貞苷含量Table 1 The content of specnuezhenide in 91 samples

2.3 建立特女貞苷近紅外定量分析模型

2.3.1 校正集和驗證集樣品的選擇

根據(jù)女貞子藥材中特女貞苷含量分布情況，從91 份樣品中選取71 份具有代表性的樣品組成校正集，用于建立近紅外模型;其余20 份樣品組成驗證集，對模型進行驗證。校正集與驗證集的選擇原則為驗證集的特女貞苷含量分布范圍應在校正集的特女貞苷含量分布范圍之內(nèi)。表2 為校正集和驗證集樣品的特女貞苷含量的分布范圍。

表2 校正集與驗證集樣品的特女貞苷含量分布范圍Table 2 The content distribution of calibration set and validation set for specnuezhenide content

2.3.2 光譜預處理方法的選擇

在建立近紅外定量分析模型前，首先要對樣品的近紅外原始吸收光譜進行預處理，為了消除光譜噪音、顆粒散射、光譜漂移等非線性因素對定量結果的影響。常用的預處理方法有多元散射校正法(MSC)，標準歸一化法(SNV)，一階導數(shù)法(First derivative)，二階導數(shù)法(Second derivative)，Savitzky-Golay 濾波法，Norris derivative 濾波法［8］等。表3為使用不同的預處理方法后，校正集內(nèi)部交叉驗證相關系數(shù)(R2)、校正均方差(RMSEC)及驗證集預測均方差(RMSEP)的比較。其中，R2越接近1 模型越好，真實值和預測值相關性越好;RMSEC 和RMSEP越小且越接近越好，所建模型的適用性越強，預測結果越準確［9］;同時，要保證RMSEC 應小于RMSEP，否則會出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象［10］。本實驗結果以SNV+SD+ND 預處理效果最好，可以消除樣品光譜噪音以及漂移所造成的影響，強化樣品近紅外光譜的譜帶特征，并克服樣品譜帶重疊的現(xiàn)象，因此選用此法為光譜預處理的最佳方法。

表3 不同預處理方法對定量模型性能的影響Table 3 The effects of different pretreatment methods on quantitative model performance

SNV+SD+ND 最佳光譜預處理方法處理后得到的近紅外光譜見圖2。

圖2 預處理后的近紅外光譜Fig.2 The near-infrared reflectance spectra after pretreatment

2.3.3 建模波段的選擇

在建立模型時需要不斷地選擇波段范圍以調整模型的準確性，以R2和RMSECV 為指標，其中，R2越接近1，RMSECV 越小，模型越好。采用最佳預處理方法，即SNV+SD+ND，對不同的波段進行手動優(yōu)化比較，選擇最佳波段范圍。結果見表4，在波段區(qū)間4007.35～9987.74 cm-1，R2最接近1，RMSECV最小，故此波段選為最佳建模波段。

表4 不同光譜范圍對R2 和RMSECV 的影響Table 4 The effects of different spectral range on R2 and RMSECV

2.3.4 主成分數(shù)的選擇

在建模過程中，采用不同的主成分數(shù)，模型的預測能力不同，主成分數(shù)太多，模型包含過多的測量噪音，校正過程會出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象;主成分數(shù)太少，建模信息不全，預測能力差［11］。采用內(nèi)部交叉驗證考察主成分數(shù)對內(nèi)部交叉驗證均方差(RESECV)的影響，RESECV 隨主成分數(shù)變化的曲線見圖3。從圖中可以看出，當偏最小二乘法因子數(shù)為7 時，RESECV 最小，為最佳建模主成分數(shù)。

圖3 主成分數(shù)對RMSECV 的影響Fig.3 The RMSECV value with different factors for specnuezhenide

2.4 定量模型的建立

運用TQ Analyst8.0 分析軟件，91 份樣品進行建模，對光譜采用SNV+SD+ND 預處理方法，在4007.35～9987.74 cm-1波段范圍，7 個主成分數(shù)進行建模。用校正集樣品進行內(nèi)部驗證，R2為0.98075，RMSEC 為0.216，RMSEP 為0.223，RMSECV 為0.52276。特女貞苷的NIR 預測值與HPLC參考值的相關圖見圖4，偏差圖見圖5，可以看出預測值與參考值的相關性較高，且結果很接近，模型的性能較好，該模型可以用于女貞子藥材中特女貞苷的定量分析。

圖4 特女貞苷NIR 預測值與HPLC 參考值的相關圖Fig.4 Correlation between NIR predicted and reference values for specnuezhenide

2.5 定量模型的驗證

圖5 特女貞苷NIR 預測值與HPLC 參考值的偏差圖Fig.5 Deviation between NIR predicted and reference values for specnuezhenide

為評價模型的實際預測效果，將20 份驗證集樣品的近紅外光譜輸入所建定量模型中，預測其特女貞苷的含量，結果見表5。驗證集的最大絕對誤差為0.35%，最小絕對誤差為0.00%，相對誤差均不超過5.83%，平均相對誤差為2.83%。由此可見NIR 預測值與HPLC 參考值非常接近，該定量分析模型準確可靠，預測能力較好，可以準確預測相應范圍內(nèi)女貞子藥材中特女貞苷的含量。

表5 20 份驗證集樣品的近紅外定量模型預測值Table 5 NIR predicted values of 20 validation set

3 討論

本實驗采用2010 年版《中國藥典》一部中女貞子項下特女貞苷的HPLC 含量測定方法進行測定，并對每份樣品平行重復測定2 次，取2 次測定結果的平均值作為建立近紅外定量分析模型的NIR 參考值，可以保證所建模型的準確性。

近紅外定量分析模型的適用范圍取決于校正集樣品指標性成分的含量范圍。本實驗收集到的女貞子藥材來自浙江、湖南、河南、四川等多個產(chǎn)地，涵蓋范圍較廣且分布較為均勻，具有一定的代表性。因此，所建模型適用性較強，可用于女貞子藥材中指標性成分特女貞苷的含量預測。

本實驗運用近紅外光譜技術結合偏最小二乘法建立了一種快速測定女貞子藥材中特女貞苷含量的新方法，該方法簡單準確，快速無污染。相比2010年版《中國藥典》中規(guī)定采用高效液相色譜法對女貞子中特女貞苷進行含量測定，雖然HPLC 的測定結果較準確，但是其前處理繁瑣復雜，且化學試劑污染空氣環(huán)境，測定過程較長。反觀近紅外光譜技術，分析速度快，獲得信息多，簡便快捷，非破壞性分析等優(yōu)點使其成為一種“綠色”分析技術，測定過程不用化學試劑、不污染環(huán)境，真正實現(xiàn)“綠色”檢驗，節(jié)約檢測成本，將會在中藥制藥行業(yè)發(fā)揮越來越大的作用。

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