Folin-Ciocalteu 比色法測定銅藻中褐藻多酚含量的研究

段海霞，林云霞，張金榮，嚴(yán)小軍，駱其君

寧波大學(xué)海洋學(xué)院 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗室，寧波 315211

銅藻(Sargassum horneri)，又名丁香屋，隸屬圓子綱(Cyclospreae)、墨角藻目(Fucales)、馬尾藻科(Sargassaceae)、馬尾藻屬(Sargassum)，為北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻。銅藻在我國沿海分布廣泛，是暖溫帶海域營造海洋牧場，進(jìn)行生物修復(fù)海洋生態(tài)的首選品種［1］。銅藻作為海藻工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料，已廣泛用于食品、飼料工業(yè)，具有較高的商業(yè)價值［2，3］。近年來，隨著我國海藻資源開發(fā)利用研究的快速發(fā)展，銅藻因富含多糖、褐藻多酚、巖藻黃素等多種生物活性物質(zhì)而引起了人們的廣泛關(guān)注，但對其中褐藻多酚的研究不多［4］。褐藻多酚(phlorotannins)是海洋褐藻中重要的次級代謝產(chǎn)物，化學(xué)結(jié)構(gòu)上是一類以間苯三酚為基礎(chǔ)骨架的獨(dú)特的多酚類化合物，其聚合度可以幾個至幾百個，并具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗心血管疾病、抗糖尿病綜合癥、保肝等多種生物活性［5-7］。嚴(yán)小軍等以Folin-Denis法測定了中國常見海藻的褐藻多酚含量，并研究了褐藻多酚含量隨海藻生長及季節(jié)的變化規(guī)律［8］。

目前，植物多酚含量測定的最常見方法——Folin-Ciocalteu 比色法［9-11］。鑒于褐藻多酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)類型為多酚類化合物，故本研究選擇Folin-Ciocalteu 比色法進(jìn)行銅藻中褐藻多酚的含量測定。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，分別考察檢測波長、顯色溫度、顯色時間、Folin-Ciocalteu 試劑和堿液用量等測定條件對Folin-Ciocalteu 比色法的影響，確定Folin-Ciocalteu 比色法測定銅藻中褐藻多酚含量的最優(yōu)條件，為銅藻中褐藻多酚提取工藝的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

新鮮銅藻于2013 年5 月采自浙江溫州南麂島，樣品由寧波大學(xué)駱其君教授鑒定，編號為NJD20130501，保存于寧波大學(xué)海洋學(xué)院。

1.2 儀器

752N 紫外-可見分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司);SB4200D 超聲波清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);BSA124S-CW 電子天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司);超純水儀(Pall 公司);RXZ-380B 型智能人工氣候箱(寧波江南儀器廠);移液器(德國Eppendorf 公司);1 cm 石英比色皿(上海尤尼柯儀器有限公司)。

1.3 試劑

Folin-Ciocalteu 試 劑(Sigma 公 司，批 號BCBL4436V);沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma 公司，批號AGM01-HOSS);其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗方法

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取沒食子酸對照品0.100 g，用重蒸餾水完全溶解并定容至100 mL，配成質(zhì)量濃度1000 μg/mL 沒食子酸儲備溶液(現(xiàn)配)。

2.2 沒食子酸工作液的配制

用移液管分別移取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL 的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100 mL容量瓶中，分別加水定容至刻度，搖勻，配置質(zhì)量濃度分別為15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL 的沒食子酸工作液，待用。

2.3 供試品溶液的制備

稱取新鮮銅藻1.000 g 于錐形瓶中，加入50 mL 60%(V/V)乙醇溶液，40 ℃超聲提取30 min，過濾至50 mL 容量瓶，加60%乙醇定容至50 mL，待用。

2.4 Folin-Ciocalteu 法測定褐藻多酚的比色條件優(yōu)化

2.4.1 檢測波長的選取

精密量取沒食子酸工作液(50 μg/mL)、供試品溶液1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，分別加水稀釋，加1.25 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應(yīng)60 min，以試劑空白為對照，在400～800 nm 范圍內(nèi)掃描確定最大吸收波長。

2.4.2 顯色溫度的考察

精密量取沒食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀釋，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，分別于15、20、25、30、35、40 ℃條件下避光反應(yīng)60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定溶液吸光值，以考察反應(yīng)溫度對比色效果的影響。

2.4.3 顯色時間的影響

取沒食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀釋，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃分別避光反應(yīng)30、60、90、120、150、180 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定溶液吸光度，以確定顯色完全的最佳時間。

2.4.4 Folin-Ciocalteu 試劑的加入量

取沒食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀釋，分別加入0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應(yīng)60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定溶液吸光度，以考察Folin-Ciocalteu 試劑用量對顯色效果的影響。

2.4.5 Na2CO3溶液用量的確定

取沒食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀釋，加Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min，分別加入3.2、4.0、4.8、5.6、6.4 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應(yīng)60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定溶液吸光度，考察Na2CO3溶液用量對吸光度的影響。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取不同濃度的沒食子酸工作液各1.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，加水稀釋，分別加入1.25 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻，3 min 后加入0.1 g/mL Na2CO3溶液4.0 mL，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應(yīng)60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，褐藻多酚含量以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品計。

2.6 Folin-Ciocalteu 法測定銅藻中褐藻多酚的方法學(xué)評價

2.6.1 穩(wěn)定性實(shí)驗

精密量取同一銅藻供試品溶液按2.4 的測定條件，分別在樣品液與顯色劑反應(yīng)完全(60 min)后的0、30、60、90、120 min 測定吸光度，以評價該方法在一段時間內(nèi)的穩(wěn)定性。

2.6.2 重現(xiàn)性實(shí)驗

分別取同一銅藻樣品5 份，依2.3 的方法制備供試品溶液，分別測定其多酚含量，計算結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以評價該方法的重現(xiàn)性。

2.6.3 精密度實(shí)驗

采用優(yōu)化的Folin-Ciocalteu 比色法對同一銅藻供試液測定5 次，并計算結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，以評價該方法的精密度。

2.6.4 加標(biāo)回收實(shí)驗

精密量取已知含量的銅藻供試品溶液0.5 mL，6 份，分別加入1000 μg/mL 沒食子酸工作液0.14、0.14、0.17、0.17、0.20、0.20 mL，加水稀釋，混勻，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應(yīng)60 min，分別測定混合樣品中褐藻多酚含量，并計算其回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，以評價該分析方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

2.7 含量測定

精確量取2.3 中的銅藻供試液1.0 mL，5 份，加水稀釋，混勻，加入Folin-Ciocalteu 試劑1.25 mL，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應(yīng)60 min。反應(yīng)完全后，利用紫外-可見分光光度計，于760 nm 下測定體系吸光值，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品所得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算銅藻供試液中褐藻多酚的含量，公式如下:

褐藻多酚含量(mg/g)=C×V/m

式中，C:銅藻供試液中多酚濃度(mg/mL);V:銅藻供試液總體積(mL);m:銅藻質(zhì)量(g)。

3 結(jié)果與分析

3.1 檢測波長的確定

多酚類物質(zhì)與Folin-Ciocalteu 試劑反應(yīng)顯色是基于Folin-Ciocalteu 試劑中的鎢鉬酸能將多酚化合物定量氧化，自身被還原，生成藍(lán)色物質(zhì)，在680～780 nm 有較大吸收，測定顯色反應(yīng)后溶液的紫外-可見吸收光譜，選擇最大吸收波長作為比色法的測定波長。圖1 為沒食子酸工作液(50 μg/mL)和供試品溶液分別與Folin-Ciocalteu 試劑顯色后的全波長掃描圖，由圖1 可知，兩者均在760 nm 處有最大吸收，故選擇760 nm 為檢測波長。

圖1 沒食子酸(a)、供試品(b)和試劑空白(c)分別與Folin-Ciocalteu 試劑顯色后的全波長掃描Fig.1 Scanning spectra of gallic acid(a)，testing solutions(b)and sample blank(c)reacted with Folin-Ciocalteu reagent

3.2 顯色溫度和時間的確定

圖2 吸光度隨反應(yīng)溫度的變化Fig.2 The absorbance at different reaction temperatures

酚類化合物與Folin-Ciocalteu 試劑反應(yīng)需要一定顯色溫度和時間才能顯色完全。由圖2 可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溫度條件下顯色，顯色溫度對比色效果影響較大，反應(yīng)溫度過低、過高均不利于多酚顯色。當(dāng)溫度低于30 ℃時，吸光度較小。30℃顯色，反應(yīng)60 min 時，吸光度達(dá)到最大，吸光值為0.705。35～40 ℃，顯色60 min 時，吸光度逐漸減小。說明溫度高能加快顯色進(jìn)程，但是溫度過高，反應(yīng)體系的穩(wěn)定性較差。綜合考慮顯色的完全程度和反應(yīng)體系的穩(wěn)定性，確定顯色溫度為30 ℃。

圖3 吸光度隨反應(yīng)時間的變化Fig.3 The absorbance at different reaction times

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同溫度條件下顯色，達(dá)到最大吸光度的時間有差異。由圖3 可知，沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液與Folin-Ciocalteu 試劑在30 ℃條件下，避光反應(yīng)，顯色時間60 min 內(nèi)，隨著時間的延長，吸光度增大。當(dāng)顯色60 min 時體系吸光度達(dá)到最大。顯色60 min 后，體系吸光度變化很小，表明顯色反應(yīng)基本完全，顯色體系穩(wěn)定性很好。因此，確定Folin-Ciocalteu 比色法的反應(yīng)時間為60 min。

綜上所述，確定Folin-Ciocalteu 比色法測定褐藻多酚含量的顯色溫度為30 ℃，顯色時間為60 min。

圖4 吸光度隨Folin-Ciocalteu 試劑用量的變化Fig.4 The absorbance at different addition amounts of Folin-Ciocalteu reagent

3.3 Folin-Ciocalteu 顯色劑和Na2CO3加入量的確定

Folin-Ciocalteu 顯色劑的用量對顯色效果具有較大影響，由圖4 可知，F(xiàn)olin-Ciocalteu 試劑用量在0.75～1.75 mL 內(nèi)，隨著顯色劑用量的增加，測得的吸光度增加;當(dāng)Folin-Ciocalteu 試劑加入量為1.25 mL，吸光度達(dá)到最大，吸光值為0.707。當(dāng)顯色劑用量超過1.25 mL 后，吸光度略有下降。因此，確定Folin-Ciocalteu 試劑的加入量為1.25 mL。

圖5 吸光度隨10% Na2CO3溶液加入量的變化Fig.5 The absorbance at different addition amount of 10%Na2CO3solution

酚類化合物與Folin-Ciocalteu 試劑反應(yīng)必須在堿性條件才可以顯色，反應(yīng)體系中Na2CO3溶液是顯色的支持介質(zhì)。由圖5 可知:隨著Na2CO3用量的增加，體系吸光度逐漸升高，當(dāng)Na2CO3用量為4.0 mL 時，吸光度達(dá)到最大。但進(jìn)一步增加Na2CO3溶液吸光度變化幅度不大，因此確定0.1 g/mL Na2CO3溶液的加入量為4.0 mL。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密量取不同濃度的沒食子酸工作液各1.0 mL，按照2.4 確定的最優(yōu)比色條件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程為Y=0.0138X+0.0267，相關(guān)系數(shù)R2=0.9993。表明沒食子酸質(zhì)量濃度在15～50 μg/mL 范圍內(nèi)，與其吸光值呈良好的線性關(guān)系，符合朗伯-比爾定律，可用于銅藻中褐藻多酚的含量測定。

3.5 Folin-Ciocalteu 法測定褐藻中褐藻多酚的方法學(xué)評價

穩(wěn)定性實(shí)驗:對Folin-Ciocalteu 比色法測定的銅藻中的褐藻多酚進(jìn)行穩(wěn)定性實(shí)驗，反應(yīng)完全后在30℃下避光放置0、30、60、90、120 min 后測定吸光值，其吸光值分別為0.508、0.501、0.499、0.512、0.499，結(jié)果表明隨著時間的延長，吸光度值略有下降，但幅度不大，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.169%，表明120 min 內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

精密度實(shí)驗:對Folin-Ciocalteu 比色法測定的銅藻中的褐藻多酚進(jìn)行精密度實(shí)驗，同一樣液測定5次，吸光值分別為0.487、0.491、0.510、0.497、0.497，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.754%，表明該方法具有較高的精密度，能夠滿足樣液分析的要求。

重現(xiàn)性實(shí)驗:對Folin-Ciocalteu 比色法測定的銅藻中的褐藻多酚進(jìn)行重現(xiàn)性實(shí)驗，取同一批銅藻樣品5 份，各1.0 g，精密稱定，按2.3 的方法，分別測定吸光度，吸光值分別為0.488、0.492、0.498、0.499、0.502，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)1.145%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

加標(biāo)回收率試驗:按照2.6 的方法進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，由表1 可以看出采用Folin-Ciocalteu 比色法測定銅藻中褐藻多酚的加標(biāo)試驗中，回收率最高的為99.36%，最低為92.50%，平均回收率96.18%，其RSD 為2.44%。結(jié)果表明，該方法具有較高的準(zhǔn)確性和可靠性，可以用于銅藻中褐藻多酚含量的測定。

3.6 銅藻中褐藻多酚的含量

按照2.7 中的方法測定銅藻中褐藻多酚的含量分別為17.44、17.58、17.08、17.18、17.51 mg/g，其平均含量為17.36 mg/g(RSD=1.25%)。

表1 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 1 Results of recovery experiment

4 結(jié)果與討論

綜上所述，考慮影響多酚含量測定的主要因素:檢測波長、顯色溫度、顯色時間、Folin-Ciocalteu 試劑和堿液用量，確定Folin-Ciocalteu 比色法測定銅藻中褐藻多酚含量的測定條件為:精密量取銅藻供品溶液1.0 mL，加水稀釋，加1.25 mL Folin-Ciocalteu 試劑，混勻，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混勻，30 ℃避光反應(yīng)60 min，以試劑空白為對照，在760 nm 波長處測定吸光度。方法學(xué)實(shí)驗證明該方法具有操作簡單、精密度高、穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，可用于銅藻中褐藻多酚含量的測定。

1 Sun JZ(孫建璋)，Zhuang DG(莊定根)，Chen WD(陳萬東).Studies on sexual reproduction and seedling production of the brown alge Sargassum horneri.South China Fish Sci(南方水產(chǎn))，2008，4(2):6-14.

2 Sun JZ(孫建璋)，Zhuang DG(莊定根)，et al.Study on Sargassum herneri(Tarn)Ag around Nanji Islands.Mod Fish Inf(現(xiàn)代漁業(yè)信息)，2009，24(5):19-21.

3 Gu LX(顧麗霞)，Liu LJ(劉麗佳)，He ST(何淑婷)，et al.Study on water extraction technology and antioxidative activity of polysaccharides from Sargassum herneri.J Anhui Agric Sci(安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2014，42:10139-10141.

4 Yuan QX(袁清香)，F(xiàn)u L(付玲).Study on the chemical constituents of brown alga Sargassu horneri.Guangdong Chem Ind(廣東化工)，2006，33(5):42-43.

5 Wei YX(魏玉西)，Guo DS(郭道森)，Niu XZ(牛錫珍)，et al.Researching progresses in brown algal poly phenolics.Mar Sci(海洋科學(xué))，2002，26(10):18-19.

6 Qin XL(秦緒龍)，Wan SB(萬升標(biāo))，Jiang T(江濤)，et al.Research progresses in Eckols of phlorotannins.Trans Oceanol Limnol(海洋湖沼通報)，2007，Suppl 1:176-181.

7 Zhang LB(張麗斌)，Xiong HJ(熊何健)，Wu JN(吳靖娜)，et al.Study on biological activity and extract technology of phlorotannins.J Fujian Fish(福建水產(chǎn))，2013，12:480-484.

8 Yan XJ(嚴(yán)小軍)，Zhou TC(周天成)，et al.Quantitative determination of phlorotannins from some Chinese common brown sea weeds.Mar Sci(海洋科學(xué))，1996，5:39-42.

9 Liu ZJ(劉子衿)，Li Q(李倩)，Zhang F(張楓).Spectrophotometric determination of the total phenolic content in Prunella vulgaris L.by Folin-Ciocalteu reagent.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2013，25:212-216.

10 Li YC(李穎暢)，Lv YF(呂艷芳)，Li JR(勵建榮).Determination of polyphenol content in different varieties blueberry leaves by Folin-Ciocalteu colorimetry.J Chin Inst Food Sci Tech(中國食品學(xué)報)，2014，14:273-278.

11 Zhang J(張軍)，Li JX(李江遐)，Lu CZ(陸翠珍)，et al.Determination of the total content of polyphenols in the leaf of mulberry by Folin-ciocalteu colorimetry.Acta Laser Biol Sin(激光生物學(xué)報)，2012，21:131-134.