四川5 個產(chǎn)區(qū)松茸揮發(fā)性成分比較研究

李 強(qiáng)，張 利，李小林，黃文麗，陳 誠，楊志榮，鄭林用*

1 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所;2 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，成都 610064;3阿壩州林業(yè)科學(xué)技術(shù)研究所，汶川 623000;4 四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，成都 610065

松茸［Tricholoma matsutake(S.Ito et Imai)Sing.］是一種珍貴的食藥用菌，分布于東北亞及北歐部分國家［1］。營養(yǎng)價值豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素等，而且其子實體含多種生物活性物質(zhì)與香味成分［2-4］。由于對環(huán)境要求苛刻，至今尚不能完全實現(xiàn)人工栽培。

四川是中國重要的松茸產(chǎn)區(qū)，四川松茸主要分布于橫斷山區(qū)，由于長期的地理隔離及氣候生境差異，每個產(chǎn)區(qū)松茸品質(zhì)及香味呈現(xiàn)一定程度的差異，形成了獨特的地域性特征［5］。揮發(fā)性成分作為松茸的次生代謝產(chǎn)物，它的種類及含量信息，可以作為鑒定松茸的化學(xué)手段［6，7］。目前，對松茸揮發(fā)性成分，學(xué)者已做了大量研究［8］。CHO 等［9，10］研究了松茸不同生長階段及烹飪前后松茸揮發(fā)性成分的變化，閏吉昌等［11］也研究了松茸菌絲與子實體的揮發(fā)性成分差異，黃小菲等［12］研究了西南部分地區(qū)松茸子實體揮發(fā)性成分的地區(qū)性差異，而且Sawahata等［13］研究證明，松茸子實體內(nèi)的揮發(fā)性成分1-辛烯-3-醇及肉桂酸甲酯具有抵御彈尾目食菌類昆蟲的能力。但目前尚未有人對四川野生松茸資源揮發(fā)性成分的地域性差異進(jìn)行全面研究，導(dǎo)致各地對松茸的開發(fā)利用較為盲目，品質(zhì)參差不齊，價格差異很大，影響了對松茸資源的合理有效利用。

本研究采用頂空固相微萃取結(jié)合GC-MS 定性定量分析四川小金、雅江、九龍、康定、理縣野生新鮮松茸的揮發(fā)性成分，并探討產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境對松茸香氣的影響，為提升松茸品質(zhì)提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生新鮮松茸子實體分別采自四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣、理縣，四川省甘孜藏族自治州雅江縣、九龍縣、康定縣。經(jīng)四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鑒定確為松口蘑(Tricholoma matsutake)每個縣采集不同海拔(表1)，不同生長時期的松茸250 g 作為一個樣測定揮發(fā)性成分。標(biāo)本保存于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所。二氯甲烷、無水乙醚、無水硫酸鈉(均為分析純)購自成都市蜀都化工試劑廠。

表1 采樣數(shù)據(jù)記錄表Table 1 Samples of T.matsutake for analysis

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 7890N/5975 氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)儀(美國Agilent 公司);A11BS25 粉碎機(jī)(德國IKA 公司);SPME 手動進(jìn)樣手柄、65 μm PDMS/DVB 萃取頭(美國Supelco 公司)。

1.3 揮發(fā)性成分萃取

取50 g 野生松茸(磨碎混合)放置在15 mL 樣品瓶中，在50 ℃條件下用65 μm PDMS/DVB 萃取頭頂空靜態(tài)吸附40 min，然后在氣質(zhì)聯(lián)用儀的氣相色譜進(jìn)樣口于250 ℃解析2 min，用于GC-MS 檢測。

1.4 氣相色譜-質(zhì)譜測定

1.4.1 色譜條件［14］

色譜柱:DC-1MS 石英毛細(xì)柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);升溫程序:80 ℃保持2 min，以15℃/min 升至200 ℃，再以20 ℃/min 升至280 ℃，保持15 min;載氣(He)流速1.46 mL/min;壓力100.0 kPa;分流比20∶1。

1.4.2 質(zhì)譜條件［14］

電子轟擊(EI)離子源;電子能量70 eV;傳輸線溫度275 ℃;離子源溫度200 ℃;母離子m/z 285;激活電壓1.5 V;質(zhì)量掃描范圍m/z 33～550。

1.5 揮發(fā)性成分定性定量分析

根據(jù)GC-MS 分析結(jié)果對野松茸子實體揮發(fā)性化合物進(jìn)行鑒定，把分離化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)計算機(jī)檢索與MAINLIB、NISTDEMO、WILLEY 3 個標(biāo)準(zhǔn)譜庫相匹配。揮發(fā)性化合物定量采用峰面積歸一法(揮發(fā)性化合物的峰面積占總的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的峰面積的百分比表示)。

2 結(jié)果與分析

2.1 四川松茸主要揮發(fā)性成分分析

采用頂空固相微萃取提取小金、雅江、康定、九龍、理縣5 個產(chǎn)區(qū)新鮮野生松茸子實體樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)，并利用GC-MS 技術(shù)分析其化學(xué)成分，經(jīng)質(zhì)譜掃描后得各個色譜峰的質(zhì)譜圖，對質(zhì)譜圖進(jìn)行計算機(jī)檢索，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行人工解析，在5 個產(chǎn)地松茸子實體中分別確定出30、25、18、16 和28個化合物，共計52 種，按峰面積歸一化法求得各成分的峰面積相對含量，結(jié)果見表2。

表2 四川五個產(chǎn)區(qū)松茸揮發(fā)性成分Table 2 Volatile components identified in T.matsutake from 5 different geographical origins by GC-MS

nd:未檢測到。nd:not detected.

由表2 可知，C8類化合物3-Octanone(3-辛酮)、1-Octen-3-ol(1-辛烯-3-醇)、(E)-2-Octenal(反-2-辛烯醛)、Phenylacetaldehyde(苯乙醛)及其它脂肪族化合物Hexanal(己醛)、Benzaldehyde(苯甲醛)、1-Nonanal(壬醛)、d-Limonene(右旋萜二烯)、Methyl cinnamate(肉桂酸甲酯)是松茸的主要揮發(fā)性成分，也是五個產(chǎn)區(qū)松茸子實體中的共有成分，占所有檢測出的揮發(fā)性成分含量的70%以上，它們共同形成了松茸獨特的香味。據(jù)報道，這些C8類化合物是在亞油酸及亞麻酸酶促代謝過程中產(chǎn)生的，在食用菌生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用［14］。1-Octen-3-ol(1-辛烯-3-醇)及Methyl cinnamate(肉桂酸甲酯)是四川松茸的主要揮發(fā)性成分，同樣也存在于日本及中國東北松茸子實體中［14，16］，它具有保護(hù)松茸子實體抵御彈尾目食菌類昆蟲的能力［13］，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于制藥領(lǐng)域，同時作為蚊蟲引誘劑被應(yīng)用于滅蚊產(chǎn)品中。d-Limonene(右旋萜二烯)由于其藥理活性，可以作為膳食化療劑，治療實體瘤及神經(jīng)膠質(zhì)瘤。可見，松茸子實體中的揮發(fā)性物質(zhì)除了在松茸代謝及自我保護(hù)過程中發(fā)揮重要作用外，還具有良好的醫(yī)藥及工業(yè)應(yīng)用前景。同時這些揮發(fā)性化合物的形成機(jī)制及在松茸代謝中發(fā)揮的生理生化作用有待進(jìn)一步研究。

研究報道，野松茸干品主要的風(fēng)味成分可能是酯類物質(zhì)、含氮雜環(huán)化合物和酸類物質(zhì)［8］，但本實驗檢測到的新鮮松茸的揮發(fā)性成分含氮雜環(huán)化合物較少，這可能是由于松茸地理來源不同，導(dǎo)致?lián)]發(fā)性成分出現(xiàn)一定的差異，也可能是前期樣品不同的處理造成結(jié)果上的偏差。而松茸干品與新鮮松茸的主要揮發(fā)性成分均為1-Octen-3-ol(1-辛烯-3-醇)及Methyl cinnamate(肉桂酸甲酯)，顯示這兩種化合物是形成松茸獨特風(fēng)味的重要物質(zhì)。不同的是，松茸干品中Methyl cinnamate(肉桂酸甲酯)的相對含量幾乎是新鮮松茸的4 倍，造成這種差異可能是樣品的干燥處理造成的。

2.2 不同產(chǎn)區(qū)松茸揮發(fā)性成分差異

從表2 可以看出，不同產(chǎn)區(qū)松茸均含有特有的揮發(fā)性成分，如小金松茸含有Furfural(糠醛)、Caprinaldehyde(癸醛)、(E)-2-Nonenal((E)-壬烯醛)等獨特成分，其中Furfural(糠醛)具有苦杏仁味，而(E)-2-Nonenal［(E)-壬烯醛］具有芳香味，它們的存在使小金松茸相較于其它地區(qū)的松茸呈現(xiàn)不一樣的氣味。(E)-2-Decen-1-ol(反式-2-癸烯醇)與Methyl trans-cinnamate(反式-肉桂酸甲酯)只在雅江松茸中被檢測到，相較于其它地區(qū)松茸僅存在Methyl cinnamate(肉桂酸甲酯)，雅江松茸同時存在Methyl trans-cinnamate(反式-肉桂酸甲酯)與Methyl cinnamate(肉桂酸甲酯)，證明雅江松茸具有與其它地方松茸不同的代謝特點與代謝產(chǎn)物。beta-Pinene(β-蒎烯)與3-carene(3-蒈烯)是康定松茸特有的揮發(fā)性成分，具有濃烈的松節(jié)油與松木香，這可能與康定松茸的生長環(huán)境有關(guān)，康定松茸生長在以松樹為優(yōu)勢樹種的高山上，并且與松樹根部共生，松茸生長發(fā)育的過程中會不斷與共生植物根部進(jìn)行物質(zhì)交換，這種代謝活動不可避免地會影響松茸的代謝產(chǎn)物，這與其他樣地以高山櫟為共生樹種不同，可能是導(dǎo)致康定松茸呈現(xiàn)松木香味的直接原因。九龍松茸也含有L-Camphene，4-(Methoxycarbonyl)styrene(4-乙烯基苯基甲酯)等獨特成分，而理縣松茸含有3-Furaldehyde(3-糠醛)、3，7-Dimethyl-1，3，6-octatriene(羅勒烯)等獨特?fù)]發(fā)性成分，3，7-Dimethyl-1，3，6-octatriene(羅勒烯)呈現(xiàn)青草香味，這可能也與理縣松茸獨特的生長環(huán)境有關(guān)，理縣松茸發(fā)生地，腐殖質(zhì)層較薄，而周圍草本植物較多，而其它地區(qū)松茸發(fā)生地腐殖層較厚，幾乎沒有草本植物生長。這些獨特的揮發(fā)性成分可以作為鑒定及區(qū)分各個產(chǎn)區(qū)松茸的化學(xué)輔助手段。雅江與小金松茸共同含有一些具有玫瑰及果香的揮發(fā)性成分如2-Pentylfuran(2-正戊基呋喃)、octanal(正辛醛)、(E，E)-2，4-Nonadienal［(E，E)-2，4-壬二烯醛］，而康定與理縣的松茸也共同含有一些具有檸檬味的揮發(fā)性成分，如Cajeputene(雙戊烯)等，這證明不同產(chǎn)區(qū)揮發(fā)性成分種類存在一定差異的同時，也具有一定的一致性。同時各揮發(fā)性成分的含量也出現(xiàn)出較大的差異，例如作為松茸主要揮發(fā)性成分的1-Octen-3-ol(1-辛烯-3-醇)及Phenylacetaldehyde(苯乙醛)，在九龍松茸中的含量相對較少，而Methyl cinnamate(肉桂酸甲酯)與(E)-2-Octenal(反-2-辛烯醛)相較于其它地區(qū)的松茸在九龍松茸中的含量則較高。綜合來看，九龍松茸與其他地方的松茸差異較大，究其原因，可能是九龍松茸的生長環(huán)境較為獨特，除了海拔、地理環(huán)境的差異外，九龍松茸的共生樹種與其他四個產(chǎn)區(qū)高山櫟為主不同，其共生樹種主要是落葉松，這可能會對其產(chǎn)區(qū)的松茸揮發(fā)性成分產(chǎn)生一定程度的影響。但需進(jìn)一步探究具體是那種或那些環(huán)境因子會對松茸的揮發(fā)性成分產(chǎn)生較大影響.

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取提取來自四川五個松茸主產(chǎn)區(qū)小金、雅江、康定、九龍、理縣鮮松茸子實體樣品中的揮發(fā)性成分，并利用GC-MS 技術(shù)和峰面積歸一法對其進(jìn)行分析，在5 個產(chǎn)地松茸子實體中分別確定出30、25、18、16 和28 個化合物，共計52 種，主要包括醇、醛、酸、酯、烯烴、烷烴、酚、酰胺、腈、磷脂等10 類化合物。C8 類化合物3-Octanone(3-辛酮)、1-Octen-3-ol(1-辛烯-3-醇)、(E)-2-Octenal(反-2-辛烯醛)、Phenylacetaldehyde(苯乙醛)及其它脂肪族化合物Hexanal(己醛)、Benzaldehyde(苯甲醛)、1-Nonanal(壬醛)、d-Limonene(右旋萜二烯)、Methyl cinnamate(肉桂酸甲酯)是松茸的主要揮發(fā)性成分，也是五個產(chǎn)區(qū)松茸子實體中的共有成分，占所有檢測出的揮發(fā)性成分含量的70%以上，它們共同形成了松茸獨特的香味。這些揮發(fā)性物質(zhì)除了在松茸代謝及自我保護(hù)過程中發(fā)揮重要作用外，還具有良好的醫(yī)藥及工業(yè)應(yīng)用前景。

不同產(chǎn)區(qū)的揮發(fā)性成分的種類及含量不盡相同，各個產(chǎn)區(qū)松茸均含有一些獨特的揮發(fā)性成分，這導(dǎo)致各地松茸香味呈現(xiàn)一定地域性差異，這些獨特的揮發(fā)性成分可以作為鑒定及區(qū)分各個產(chǎn)區(qū)松茸的化學(xué)輔助手段。同時，研究還證明松茸的揮發(fā)性成分可能受共生植物及周圍環(huán)境的影響。未來需進(jìn)一步揭示這些揮發(fā)性化合物的形成機(jī)制及在松茸代謝中發(fā)揮的生理生化作用，并探討環(huán)境及周圍植被對松茸香味的影響，從而為提高并改善松茸品質(zhì)提供參考。

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