羧甲基殼聚糖鋅亞急性毒性研究

胡 芮，姜惠萍，宋亞楠，劉萬(wàn)順，韓寶芹

1 中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，青島 266003;2 青島博益特生物材料股份有限公司，青島 266101

羧甲基殼聚糖是一種水溶性殼聚糖衍生物，在止血、抗菌和愈創(chuàng)方面具有顯著的生物活性［1］。鋅離子為人體所必須微量元素之一，參與組成80 多種酶或者作為酶的激活劑［2］，研究表明傷口處富集的鋅離子與多種酶活性相關(guān)，從而加速傷口愈合［3］。以往對(duì)于羧甲基殼聚糖鋅的研究多集中于其形成機(jī)理和抗菌活性:羧甲基殼聚糖與鋅離子可以通過(guò)Zn離子與O 和N 離子形成的Zn-O 和Zn-N 鍵形成一種水不溶性的絡(luò)合物［4］，形成的羧甲基殼聚糖鋅對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有比羧甲基殼聚糖更強(qiáng)的抑菌效果［5］。由于羧甲基殼聚糖鋅具有多糖鏈的大分子性質(zhì)、羧甲基殼聚糖和鋅離子的促愈合活性和抗菌活性，所以被認(rèn)為是一種極具潛力的生物創(chuàng)傷敷料，但有關(guān)羧甲基殼聚糖鋅生物安全性的研究尚未報(bào)道，已有研究表明由于絡(luò)合物和金屬離子存在某種化學(xué)平衡，殼聚糖金屬絡(luò)合物中的微量金屬元素既可以保持活性并能減低毒性［2］。本試驗(yàn)就兩種不同絡(luò)合量的羧甲基殼聚糖鋅為試驗(yàn)材料，制取浸提液，研究其亞急性毒性，旨在為其生物安全性提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:昆明種小鼠，生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(魯)20140001，30 只，雌雄各半，體重為20～25 g，購(gòu)自青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物生產(chǎn)中心，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前暫養(yǎng)5 d，自由飲水飲食，適應(yīng)環(huán)境。

實(shí)驗(yàn)材料:兩種不同絡(luò)合量的羧甲基殼聚糖鋅由本實(shí)驗(yàn)室制備，羧甲基殼聚糖與鋅離子的絡(luò)合摩爾比分別為40∶1(高絡(luò)合量)和60∶1(低絡(luò)合量)。相關(guān)血清生化指標(biāo)試劑盒均購(gòu)于南京建成股份有限公司，其他試劑均為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司分析純商品試劑。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 材料浸提液制取

根據(jù)國(guó)標(biāo)醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12 部分制取材料浸提液，分別取兩種羧甲基殼聚糖鋅試驗(yàn)材料，除去吸收容量外，以0.1 g/mL 比例用無(wú)菌生理鹽水37 ℃浸提24 h，制得材料浸提液［6］。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

將30 只昆明種小鼠隨機(jī)分為3 組，實(shí)驗(yàn)組1、實(shí)驗(yàn)組2、對(duì)照組，每組10 只，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)組1小鼠腹腔注射高絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅材料浸提液，實(shí)驗(yàn)組2 小鼠腹腔注射低絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅材料浸提液，對(duì)照組小鼠腹腔注射0.9% NaCl 溶液，各組小鼠每日腹腔注射1 mL，連續(xù)注射28 d［7］。

2.3 小鼠生理狀態(tài)觀察

小鼠自由飲水飲食，每天觀察記錄各組小鼠生理狀況，每隔3～4 d 稱(chēng)量記錄小鼠體重。

2.4 相關(guān)血液生化指標(biāo)測(cè)定

在28 d 給藥完成時(shí)，小鼠空腹過(guò)夜，稱(chēng)重后眼球取血，離心取血清，測(cè)定血液常規(guī)生化指標(biāo)(谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST、堿性磷酸酶ALP、總蛋白TP、白蛋白ALB、葡萄糖GLU、尿素氮BUN、肌酐CREA、尿酸UA、甘油三酯TG)［8］。

2.5 臟器指數(shù)測(cè)定

進(jìn)行常規(guī)解剖檢查，取心、肝、脾、肺、腎和胸腺，稱(chēng)重后計(jì)算相應(yīng)器官指數(shù)(臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體重)

2.6 病理學(xué)檢查

稱(chēng)重后的各器官于中性甲醛固定2 d 后，經(jīng)過(guò)脫水、透明、包埋和切片后，進(jìn)行HE 常規(guī)染色，顯微鏡下進(jìn)行常規(guī)病理組織學(xué)檢查［9］。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果與討論

3.1 小鼠生理狀態(tài)及體重

各組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中生理活動(dòng)正常，包括外觀體征、行為活動(dòng)、腺體分泌、精神狀態(tài)、呼吸、糞便等，實(shí)驗(yàn)組1 和實(shí)驗(yàn)組2 小鼠與對(duì)照組小鼠無(wú)明顯差別。精神狀態(tài)呼吸均正常，生理狀態(tài)均良好，無(wú)中毒及死亡現(xiàn)象。各組小鼠體重變化見(jiàn)表1，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組1 和實(shí)驗(yàn)組2 小鼠體重與對(duì)照組比較，雌雄小鼠均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表1 不同組中小鼠的體重變化(g，n=10，±s)Table 1 Weight changes of mice in different groups(n=10，±s)

表1 不同組中小鼠的體重變化(g，n=10，±s)Table 1 Weight changes of mice in different groups(n=10，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，* P＜0.05;＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05;＊＊P＜0.01.

表2 不同組中小鼠各臟器指數(shù)(n=10，±s)Table 2 Organ index of mice in different groups(n=10，±s)

表2 不同組中小鼠各臟器指數(shù)(n=10，±s)Table 2 Organ index of mice in different groups(n=10，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，* P＜0.05;＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05;＊＊P＜0.01.

3.2 小鼠各臟器指數(shù)

小鼠給藥28 d 后的各臟器指數(shù)見(jiàn)表2，可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組1 高絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅浸提液腹腔給藥28d 后，雌雄小鼠各臟器指數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組2 低絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅浸提液腹腔給藥28d 后，雌性小鼠腎指數(shù)高于對(duì)照組腎指數(shù)，有顯著性差異(P＜0.05)，雄性小鼠腎指數(shù)與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。其它臟器系數(shù)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。實(shí)驗(yàn)組2 雌性小鼠腎指數(shù)高于對(duì)照組，浸提液對(duì)腎的影響情況應(yīng)結(jié)合血液生化指標(biāo)和病理切片進(jìn)行分析。

3.3 小鼠血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

給藥28d 后，小鼠血清生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，實(shí)驗(yàn)組1 給藥高絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅雄性小鼠血清中ALP、UA 含量均低于對(duì)照組，呈顯著性差異(P＜0.05)，其它生化指標(biāo)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。實(shí)驗(yàn)組2 給藥低絡(luò)合量羧甲基殼聚糖鋅雄性小鼠血清中UA 含量低于對(duì)照組，呈現(xiàn)顯著性差異(P＜0.05)，其它生化指標(biāo)與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異。尿酸和堿性磷酸酶低于正常值，是否有病理學(xué)意義還需要結(jié)合肝、腎病理切片進(jìn)行分析。

表3 不同組中小鼠血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(n=10，±s)Table 3 Blood biochemical index determination results of mice in different groups(n=10，±s)

表3 不同組中小鼠血液生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(n=10，±s)Table 3 Blood biochemical index determination results of mice in different groups(n=10，±s)

注:與空白對(duì)照組比較，* P＜0.05;＊＊P＜0.01。Note:Compare with control，* P＜0.05;＊＊P＜0.01.

3.4 小鼠器官解剖觀察

小鼠解剖過(guò)程中實(shí)驗(yàn)組各器官與正常組相比，其外觀顏色、顏色和臟器大小均表現(xiàn)正常，未見(jiàn)明顯滲出、增生、水腫、萎縮等病變，結(jié)果全部在正常形態(tài)學(xué)范圍內(nèi)，未見(jiàn)明顯病理改變。

圖1 實(shí)驗(yàn)組1(A)、實(shí)驗(yàn)組2(B)及空白對(duì)照組(C)中小鼠各器官病理切片觀察(×400)Fig.1 Organ pathological observation of mice in group 1(A)，group 2(B)and control(C)(×400)

3.5 小鼠各器官病理切片觀察

由各器官組織病理切片(見(jiàn)圖1)可見(jiàn)雌雄小鼠心、肝、脾、肺、腎和胸腺病理切片均顯示的組織結(jié)構(gòu)正常，組織內(nèi)部均未出現(xiàn)壞死、腫大，未見(jiàn)炎癥細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)均正常清晰，未見(jiàn)明顯病理改變。

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程，3 個(gè)組的雌雄小鼠毛色、精神狀態(tài)、飲食飲水量、排泄量等生理狀態(tài)均表現(xiàn)正常，無(wú)明顯區(qū)別，實(shí)驗(yàn)組雌雄小鼠體重與對(duì)照組無(wú)顯著性差異，說(shuō)明材料對(duì)小鼠生理機(jī)能無(wú)明顯影響作用。

從各臟器指數(shù)和血液生化指標(biāo)測(cè)量結(jié)果可以看出，實(shí)驗(yàn)2 組雌性小鼠腎指數(shù)顯著高于對(duì)照組腎指數(shù)，實(shí)驗(yàn)1 組雄性小鼠血液中堿性磷酸酶、尿酸含量低于對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)2 組雄性小鼠尿酸在血清中含量低于對(duì)照組，但兩組雌雄小鼠肝、腎組織病理檢查均顯示組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生改變，綜合結(jié)果表明無(wú)病理意義。結(jié)果表明羧甲基殼聚糖鋅無(wú)明顯亞急性毒性，但實(shí)驗(yàn)組雄性小鼠血清中堿性磷酸酶降低、尿酸降低的原因還需要進(jìn)行深入研究。

4 結(jié)論

鋅離子為人體生命活動(dòng)中不可或缺的微量元素，但是過(guò)量的鋅對(duì)機(jī)體有損害作用，有研究表明高劑量鋅可以導(dǎo)致大鼠學(xué)習(xí)能力下降［10］，并且導(dǎo)致機(jī)體不孕不育，小鼠鋅中毒后也會(huì)表現(xiàn)食欲下降、皮毛失去光澤，運(yùn)動(dòng)量和運(yùn)動(dòng)能力下降［11］。鋅的毒性作用與其形成化合物的形式和鋅離子含量等因素有關(guān)。鋅鹽的種類(lèi)分為無(wú)機(jī)鋅和有機(jī)鋅，不同形式的鋅鹽的對(duì)不同生物的毒性劑量不同，之前有關(guān)于鋅離子的毒性評(píng)價(jià)研究多著重于攝入性毒性，研究表明人的食物中鋅的最高允許劑量為40～60 mg/kg，有機(jī)鋅與無(wú)機(jī)鋅相比生物學(xué)效價(jià)更高，更易被生物體吸收利用，因此更容易導(dǎo)致鋅中毒［12］。然而對(duì)于其作為醫(yī)用材料組成成分，關(guān)于鋅離子腹腔毒性的實(shí)驗(yàn)鮮有報(bào)道。羧甲基殼聚糖是一種天然大分子材料，有研究表明它無(wú)亞慢性攝入毒性［13］、無(wú)急性攝入毒性［14，15］、擁有較好的生物相容性，實(shí)驗(yàn)中利用羧甲基殼聚糖優(yōu)異的生物學(xué)特性和較強(qiáng)的金屬配位能力，與不同比例鋅離子反應(yīng)生成了屬于多糖鋅復(fù)合物的羧甲基殼聚糖鋅，研究了制得材料浸提液通過(guò)腹腔注射對(duì)小鼠的亞急性毒性，結(jié)果表明試驗(yàn)中所制得的兩種材料無(wú)明顯亞急性毒性，為羧甲基殼聚糖鋅成為一種可以載體內(nèi)應(yīng)用的生物材料提供了基礎(chǔ)。

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