華澤蘭根的化學成分及其體外抑菌活性研究

劉夢元，虞麗娟，李燕慈，田 珂，李路軍，，吳正治

1 生物資源綠色轉(zhuǎn)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430062;2 深圳市老年醫(yī)學研究所，深圳 518020

華澤蘭(Eupatorium chinense L.)為菊科(Com-positae)澤蘭屬(Eupatorium)植物，多年生草本或半灌木，常生長于山谷、林緣、草地或灌木叢中，主要分布于中國東南部至西南部各省。其干燥根，又名廣東土牛膝、多須公、斑骨相思等。具有清熱解毒、涼血利咽、抗炎鎮(zhèn)痛的功效，主治白喉、蛾喉、咽喉腫痛等癥，有“喉科圣藥”之稱，對喉部疾病療效顯著，民間使用極為廣泛［1］。目前文獻報道從澤蘭屬植物中分離到的主要化學成分為黃酮類和倍半萜類化合物［2，3］。為分離其中抗菌活性成分，合理開發(fā)利用這一藥用植物資源，本實驗對華澤蘭根的化學成分進行了系統(tǒng)的研究。從華澤蘭根95%乙醇提取物中分離得到9 個化合物，分別鑒定為達瑪二烯醇乙酸酯(1)、(2R，3S)-5-乙?；?6-羥基-2-異丙烯基-3-乙氧基苯并二氫呋喃(2)、豆甾醇(3)、鄰苯二甲酸二丁酯(4)、12，13-dihydroxyeuparin(5)、5-乙酰-6-羥基-2-異丙烯基苯并呋喃(6)、2，5-二乙?；?6-羥基苯并呋喃(7)、ruscodibenzofuran(8)、2-乙酰-5-(1-炔丙基)-噻吩-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(9)，化合物1、2、4 和8 為首次從該種植物中分離得到，其中2、4和8 為首次從該屬植物中分離得到。在此基礎(chǔ)上，采用牛津杯法評價部分苯并呋喃類化合物的抑菌活性，并用肉湯稀釋法測定它們的MIC 值。以上研究豐富了該植物的化學成分研究內(nèi)容，探索其抗菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，有利于尋找具有潛在藥物開發(fā)價值的抗菌活性先導化合物，為充分開發(fā)利用華澤蘭奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Varian INOVA 600 型核磁共振儀(內(nèi)標為TMS，美國Varian 公司)，WNMR 400 型核磁共振儀(中科開物);X-6 顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司，溫度未校正);EZ Purifier MPLC(蘇州利穗科技有限公司);Knauer smartline 型半制備HPLC(德國，諾爾)，Agilent 1100 分析型HPLC(美國，安捷倫科技公司)，YMC-Pack ODS-A 系列色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，1 mL/min;250 mm×9.4 mm，5 μm，3 mL/min)，ZF-6 型三用紫外線分析儀(上海嘉鵬科技有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司);iMark 酶標儀;96 孔平底微孔板(Costar3599，USA，Corning);游標卡尺(富遠);牛津杯(Φ 6 mm)。

1.2 試劑

LB 培養(yǎng)基，哥倫比亞血瓊脂平板(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司);KF 鏈球菌肉湯培養(yǎng)基:青島海博生物技術(shù)有限公司;氨芐青霉素(AMP，BIOSHARP 公司生產(chǎn)，批號0339);Sephadex LH-20(GE Healthcare，Bio-sciences AB，Sweden);薄層色譜用硅膠GF254、柱色譜用硅膠(100～200 目，200～300 目)均為青島海洋化工廠產(chǎn)品;色譜甲醇為美國Tedia公司產(chǎn)品;色譜乙腈為美國fisher 公司產(chǎn)品;其他試劑為分析純。

1.3 材料與菌種

實驗用藥材采自湖南省泠水江市和青鎮(zhèn)，經(jīng)中國科學院華南植物園寧祖林博士鑒定為菊科澤蘭屬(Eupatorium)植物華澤蘭(Eupatorium chinense L.)的干燥根，樣品標本保存于湖北大學中藥生物技術(shù)湖北省重點實驗室。實驗所選菌種:大腸埃希菌(Escherichia coli)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)5 種標準菌株由華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院檢驗科饋贈。

1.4 提取與分離

華澤蘭干燥根17.5 kg，適當粉碎后用90%乙醇回流提取3 次，每次提取2 h，合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，用適量水混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，回收溶劑得石油醚萃取物375 g，乙酸乙酯萃取物412 g，正丁醇萃取物1071 g。取石油醚萃取物經(jīng)硅膠(100～200 目)柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(100∶1～1∶100)梯度洗脫得A～G 7 個流份。C 流份再次通過硅膠(200～300目)柱色譜，石油醚-乙酸乙酯(65∶1)洗脫，所得流份重結(jié)晶得化合物1(8.84 mg);D 流份經(jīng)過硅膠(200～300 目)柱色譜，用石油醚-乙酸乙酯(50∶1～40∶1)洗脫得流份D1～D5，D3經(jīng)過半制備HPLC(甲醇∶水=7∶3)得化合物2(27.6 mg);E 流份經(jīng)過硅膠(200～300 目)柱色譜用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(15∶1～10∶1)洗脫得到化合物3(10.8 mg);G 流份經(jīng)過硅膠(200～300 目)柱色譜用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(1∶1)洗脫得到G1和G2，G1通過制備薄層色譜得化合物4(70.74 mg);G2經(jīng)過半制備HPLC(乙腈∶水=6∶4)得化合物5(4.88 mg)。取乙酸乙酯萃取物經(jīng)硅膠(100～200 目)柱色譜，用二氯甲烷-甲醇(100∶1，50∶1，25∶1，10∶1，5∶1，2∶1，1∶1，1∶100)梯度洗脫，得到A～H 8 個流份，B 流份經(jīng)過MPLC(甲醇∶水=6∶4)得化合物6(48.72 mg)和化合物8(78.10 mg);C 流份經(jīng)過MPLC(二氯甲烷∶甲醇=75∶25)，再過Sephadex LH-20 凝膠得化合物7(29.89 mg)。E 流份經(jīng)過MPLC(二氯甲烷∶甲醇=10∶1)得到E1～E66 個流份，E2流份經(jīng)過半制備HPLC(乙腈∶水=1∶19～1∶0)得化合物9(3.21 mg)。

1.5 化合物抑菌活性測定

1.5.1 樣品溶液的配置

將分離得到的單體化合物1～4、6～8 分別用DMSO 溶解配制成2 mg/mL 的樣品溶液，備用。

1.5.2 菌懸液制備

取肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌分別接種于LB 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，肺炎鏈球菌接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)上，37 ℃復蘇培養(yǎng)24 h 得到單菌落，用接種環(huán)挑1～2 個菌落分別接種于配好的LB 液體培養(yǎng)基，取肺炎鏈球菌單菌落接種到KF 鏈球菌肉湯培養(yǎng)基中，分別于37 ℃，280 rpm 的搖床中培養(yǎng)8～10 h，得實驗用菌液(106～107CFU/mL)，備用。

1.5.3 抑菌活性篩選

抑菌活性采用牛津杯法進行。在無菌超凈工作臺中，將配制好的的肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌分別均勻涂抹在LB固體培養(yǎng)基上，肺炎鏈球菌均勻涂抹在哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)上。取消毒滅菌后的牛津杯放置在培養(yǎng)基表面，分別加入樣品溶液200 μL，勿使其外溢，選用DMSO 為空白對照，50 μg/mL 的AMP 作為陽性對照，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，游標卡尺測量各自的抑菌圈直徑。每個樣品平行測定3次，取平均值作為最終結(jié)果。

1.5.4 最低抑菌濃度測定

肉湯稀釋法［4］測定MIC 值，二倍稀釋法配制系列濃度的樣品溶液，終濃度分別為:250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0.25、0.125 μg/mL。分別加入20 μL，106～107CFU/mL細菌懸浮液，不添加樣品的為對照組。試管37 ℃溫浴16～18 h，用酶標儀在600 nm 條件下測樣品OD值，MIC 值為明顯抑制細菌生長的最低化合物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1 白色粉末，易溶于氯仿，mp.263～265 ℃。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:0.84，0.85，0.86，0.87，0.97，1.62，1.69(21H，s，7×CH3)，2.04(3H，s，CH3COO)，5.13(1H，tt，J=7.0，1.3 Hz，H-24)，4.74(1H，d，J=1.3 Hz，H-21a)，4.71(1H，d，J=1.3 Hz，H-21β)，4.48(1H，dd，J=11.2，4.8 Hz，H-3);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:38.1(C-1)，23.9(C-2)，81.2(C-3)，37.4(C-4)，56.2(C-5)，18.4(C-6)，35.6(C-7)，40.7(C-8)，51.1(C-9)，39.0(C-10)，21.6(C-11)，25.2(C-12)，48.0(C-13)，49.6(C-14)，31.6(C-15)，29.2(C-16)，45.6(C-17)，16.4(C-18)，16.7(C-19)，153.0(C-20)，107.7(C-21)，34.5(C-22)，27.3(C-23)，124.8(C-24)，131.6(C-25)，25.8(C-26)，17.9(C-27)，28.2(C-28)，15.9(C-29)，16.1(C-30)，171.1(C-31，Ac)，21.4(C-32，Ac)。以上數(shù)據(jù)與文獻［5］基本一致，化合物1 鑒定為達瑪二烯醇乙酸酯。

化合物2 白色針晶(氯仿)，易溶于乙酸乙酯，難溶于甲醇，mp.62～65 ℃。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:1.24(3 H，t，J=7.0 Hz，H-16)，1.69(3 H，br.s，H-14)，2.56(3 H，s，H-11)，3.60(2 H，q，J=7.0 Hz，H-15)，4.75(1 H，d，J=2.0 Hz，H-3)，5.06(1 H，d，J=2.0 Hz，H-2)，4.91(1 H，br.s，H-13α)，5.03(1 H，br.s，H-13β)，6.41(s，1H，H-7)，7.71(1H，s，H-4)，12.98(1H，s，OH);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:93.1(C-2)，82.2(C-3)，129.3(C-4)，118.7(C-5)，167.3(C-6)，98.9(C-7)，167.4(C-8)，114.7(C-9)，202.4(C-10)，26.4(C-11)，141.6(C-12)，113.4(C-13)，17.7(C-14)，63.9(C-15)，15.6(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻［6］基本一致，化合物2 鑒定為(2R，3S)-5-乙?；?6-羥基-2-異丙烯基-3-乙氧基-苯并二氫呋喃。

化合物3 白色晶體(氯仿)，與硫酸-乙醇試劑反應顯紅色，mp.145～146 ℃。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:5.35(1H，br.d，J=5.0 Hz，H-6)，3.55(1H，m，H-3)，0.69(3H，s，CH3-18)，0.83(3H，s，CH3-19)，0.91(3H，d，J=6.0 Hz，H-21)，5.13(1H，dd，J=8.0，15.1 Hz，H-22)，5.01(1H，dd，J=8.0，15.1 Hz，H-23)，0.84(3H，d，J=6.3 Hz，CH3-26)，0.79(3H，d，J=5.5 Hz，CH3-27)，0.81(3H，t，J=7.4 Hz，CH3-29);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:37.6(C-1)，32.0(C-2)，72.1(C-3)，40.6(C-4)，141.0(C-5)，121.9(C-6)，32.2(C-7)，32.2(C-8)，50.5(C-9)，36.8(C-10)，21.2(C-11)，40.0(C-12)，42.6(C-13)，56.3(C-14)，24.6(C-15)，29.1(C-16)，57.2(C-17)，12.3(C-18)，19.6(C-19)，42.5(C-20)，21.2(C-21)，138.5(C-22)，129.6(C-23)，51.5(C-24)，31.9(C-25)，19.2(C-26)，21.3(C-27)，25.6(C-28)，12.5(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻［7］基本一致，化合物3 鑒定為豆甾醇。

化合物4 黃色油狀物質(zhì)，易溶于氯仿，難溶于丙酮，甲醇。1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:7.70(2H，dd，J=3.42，5.88 Hz，H-2，5)，7.51(2H，dd，J=3.42，5.88 Hz，H-3，4)，4.30(4H，t，J=6.96 Hz，H-1＇，1＇＇)，1.75(4H，tt，J=6.96，7.68 Hz，H-2＇，2＇＇)，1.43(4H，tq，J=7.56，7.72 Hz，H-3＇，3＇＇)，0.95(6H，t，J=7.56 Hz，H-4＇，4＇＇);13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:167.8(C-7，8)，131.0(C-1，6)，128.9(C-2，5)，132.4(C-3，4)，65.7(C-1＇，1＇＇)，30.7(C-2＇，2＇＇)，19.3(C-3＇，3＇＇)，13.8(C-4＇，4＇＇)。以上數(shù)據(jù)與文獻［8］基本一致，化合物4 鑒定為鄰苯二甲酸二丁酯。

化合物5 白色粉末，溶于氯仿，UV254nm下顯紫色熒光，mp.169～171 ℃。1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:1.59(3H，s，H-14)，2.67(3H，s，H-11)，3.69(1H，d，J=11.16 Hz，H-13a)，4.00(1H，d，J=11.16 Hz，H-13β)，6.66(1H，s，H-3)，6.97(1H，s，H-7)，7.91(1H，s，H-4);13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:161.2(C-2)，103.8(C-3)，123.8(C-4)，117.1(C-5)，159.7(C-6)，99.9(C-7)，161.4(C-8)，121.1(C-9)，204.2(C-10)，27.0(C-11)，72.4(C-12)，68.9(C-13)，23.5(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］基本一致，化合物5 鑒定為12，13-dihydroxyeuparin。

化合物6 黃綠色晶體(氯仿)，易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮，mp.118～120 ℃。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ:2.08(3H，s，H-14)，2.66(3H，s，H-11)，5.17(1H，s，H-13α)，5.74(1H，s，H-13β)，6.52(1H，s，H-3)，6.95(1H，s，H-7)，7.88(1H，s，H-4)，12.48(1H，s，OH);13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ:158.2(C-2)，102.6(C-3)，123.7(C-4)，122.1(C-5)，159.9(C-6)，99.7(C-7)，161.9(C-8)，117.2(C-9)，204.0(C-10)，26.9(C-11)，132.4(C-12)，113.9(C-13)，19.4(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻［10］基本一致，化合物6 鑒定為5-乙?；?6-羥基-2-異丙烯基-苯并呋喃。

化合物7 黃色晶體，易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮，mp.144～146 ℃。1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:7.46(1H，s，H-3)，8.17(1H，s，H-4)，7.08(1H，s，H-7)，2.60(3H，s，H-13)，2.73(3H，s，H-11)，12.56(1H，s，OH-6);13C NMR(CDCl3，150 M Hz)δ:153.9(C-2)，113.2(C-3)，127.1(C-4)，118.6(C-5)，160.2(C-6)，100.5(C-7)，163.5(C-8)，119.9(C-9)，204.1(C-10)，27.1(C-11)，188.1(C-12)，26.6(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻［9］基本一致，化合物7 鑒定為2，5-二乙?；?6-羥基-苯并呋喃。

化合物8 白色晶體，易溶于氯仿，可溶于甲醇、丙酮，mp.143～145 ℃。1H NMR(CDCl3，600 MHz)δ:12.78(1H，s，OH-6)，8.30(1H，s，H-4)，7.10(1H，s，H-7)，7.13(1H，d，J=7.4 Hz，H-14)，7.03(1H，d，J=7.4 Hz，H-13)，2.76(3H，s，H-11)，2.53(3H，s，H-16)，2.74(3H，s，H-17);13C NMR(CDCl3，150 MHz)δ:155.7(C-2)，121.7(C-3)，124.8(C-4)，116.4(C-5)，163.2(C-6)，100.2(C-7)，161.4(C-8)，119.3(C-9)，203.8(C-10)，26.9(C-11)，118.5(C-12)，128.1(C-13)，124.7(C-14)，130.0(C-15)，15.0(C-16)，19.7(C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻［11］基本一致，化合物8 鑒定為ruscodibenzofuran。

化合物9 白色晶體，mp.118～119 ℃。1H NMR(CD3COCD3，400 MHz)δ:7.14(1H，s，H-4)，5.10(1H，d，J=7.56 Hz，H-1＇)，4.71，4.45，4.34，3.82(4H，br.s 4×OH)，3.91(1H，dd，J=11.4，2.0 Hz，H-6＇α)，3.72(1H，dd，J=11.4，5.6 Hz，H-6＇β)，3.59(1H，m，H-3＇)，3.54(2H，m，H-2＇，H-5＇)，3.48(1H，m，H-4＇)，2.53(3H，s，H-10)，2.09(3H，s，H-8);13C NMR(CD3COCD3，100 MHz)δ:125.3(C-2)，157.3(C-3)，124.0(C-4)，130.2(C-5)，73.7(C-6)，95.5(C-7)，4.4(C-8)，190.1(C-9)，29.8(C-10)，103.4(C-1＇)，74.7(C-2＇)，78.2(C-3＇)，71.2(C-4＇)，78.3(C-5＇)，62.5(C-6＇)。以上數(shù)據(jù)與文獻［12］基本一致，化合物9 鑒定為2-乙酰-5-(1-炔丙基)-噻吩-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

2.2 抑菌活性篩選

華澤蘭中分離得到的化合物1～4 和6～8 抑菌活性實驗結(jié)果如表1 所示，結(jié)果表明，除化合物2 對肺炎鏈球菌無明顯抑菌活性外，測試化合物對供試菌均具有不同程度的抑菌活性。相對于陽性對照組，它們對肺炎克雷伯菌均具有較強的抑菌活性，化合物7 明顯抑制大腸埃希菌生長，化合物1、6～8 對銅綠假單胞菌具有明顯的抑菌活性，所有測試化合物對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌顯示較弱抑菌活性。

表1 華澤蘭根部分化合物抑菌活性篩選(n=3)Table 1 Antibacterial activities of compounds from E.chinense root(n=3)

2.3 最低抑菌濃度測定

化合物1～4 和6～8 對5 種供試菌的MIC 值，見表2。由表中MIC 值可知，化合物2 對肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌的MIC 值分別為3.91、3.91 μg/mL?；衔?、6 和8 對肺炎克雷伯菌抑菌活性最強，MIC 值分別為0.98、0.98 μg/mL 和0.49 μg/mL。5 種測試菌種，化合物7 對大腸埃希菌顯示最強抑菌活性(MIC≤3.91 μg/mL)?；衔?、2、6和7 對銅綠假單胞菌的MIC 值均為7.81 μg/mL，化合物3 對所有測試菌的MIC 均大于250 μg/mL，所有測試化合物對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的MIC 均大于250 μg/mL。

表2 華澤蘭根部分化合物最低抑菌濃度Table 2 The minimal inhibitory concentrations of compounds from E.chinense root

3 結(jié)論

本實驗利用硅膠、Sephadex LH-20、HPLC 等各種色譜分離技術(shù)，從華澤蘭根的乙醇提取物中分離得到9 個化合物，其中，1、6 和8 對肺炎克雷伯菌有較強抑菌活性，MIC 值分別為0.98 μg/mL、0.98 μg/mL 和0.49 μg/mL，化合物7 對大腸埃希菌顯示較強抑菌活性(MIC≤3.91 μg/mL)，化合物1、2、6和7 對銅綠假單胞菌有較強抑菌活性，MIC 值均為7.81 μg/mL，由此推測化合物1 及苯并呋喃類化合物2、6、7、8 為華澤蘭根主要抑菌活性成分。

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